徐玉榮，劉啟方，廖文俊

Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT通路信號分子在黑素瘤中的表達

徐玉榮，劉啟方，廖文俊

徐玉榮

目的 探討Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT通路主要信號分子在正常人黑素細胞及不同黑素瘤細胞系中的激活狀態(tài)。方法 選取正常人原代黑素細胞（MC）及來源于原位（WM793B）、侵襲性（LIBR）及轉移性（SK-MEL-5）黑素瘤細胞系和色素痣、黑素瘤組織，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、蛋白質印跡法(Western blot)、激光共聚焦及免疫組化法檢測細胞及組織中該通路主要信號分子的表達情況。結果 與正常人黑素細胞相比，在不同黑素瘤細胞系中該通路主要信號分子Wnt5a、散亂蛋白2(DVL2)、鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CN)、活化T細胞核因子2(NFAT2)、環(huán)氧合酶-2 (COX-2)、血管內皮細胞生長因子A (VEGF-A)、黏著斑蛋白(vinculin)及波形蛋白(vimentin)明顯高表達，且Ca2+濃度較高；CN-B、NFAT2在色素痣中均為陰性表達，而在黑素瘤組織中多數呈陽性表達（P＜0.001）。在侵襲性及轉移性黑素瘤中的表達強度明顯高于原位黑素瘤。結論 在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路可能被激活，并在黑素瘤的侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用。

黑素瘤；鈣調神經磷酸酶；活化T細胞核因子； Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT通路

惡性黑素瘤（MM）是惡性程度高、容易發(fā)生轉移的皮膚惡性腫瘤，其侵襲、轉移機制目前尚不完全清楚。有關Wnt5a-Ca2+信號通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系已成為研究者關注的熱點，但其在黑素瘤發(fā)展過程中的精確調控機制尚有待進一步探討。根據文獻報道及筆者試驗組的前期研究，推測在黑素瘤細胞中存在一條Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路，并可能參與了黑素瘤的侵襲、轉移過程。為此筆者選擇正常皮膚黑素細胞及來源于不同生長期的3株黑素瘤細胞系，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白質印跡法(Western-blot)檢測該信號通路主要信號分子Wnt5a、散亂蛋白（DVL）、鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CN)、活化T細胞核因子2(NFAT2)、環(huán)氧合酶2 (COX-2)、血管內皮細胞生長因子（VEGF）、黏著斑蛋白（vinculin）、波形蛋白（vimentin）的表達水平，再用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測這4株細胞內的Ca2+濃度，最后用免疫組化檢測色素痣及原位、侵襲性和轉移性黑素瘤臨床組織標本中CN-B和NFAT2的表達，以探討Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路在不同發(fā)展期黑素瘤細胞中的激活狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及組織標本 WM 793B、LIBR、SKMEL-5黑素瘤細胞為本科室儲存，原代黑素細胞由正常男性包皮環(huán)切組織分離、培養(yǎng)獲得；所有組織標本均來源于西京醫(yī)院皮膚科，診斷結果均通過臨床、組織病理和免疫組化證實，蠟塊保存完好，臨床資料齊全。其中色素痣30例，原位、侵襲和淋巴結轉移黑素瘤各10例。

1.1.2 主要試劑 Dispase、254及K-SFM培養(yǎng)基（GIBCO），Trizol（Invitrogen公司），反轉錄試劑盒（TaKaRa公司），PCR引物由TaKaRa合成，RIPA裂解液及BCA法蛋白含量檢測試劑盒（beyotime公司），一抗為兔抗人NFAT2抗體（cell signaling公司）及Wnt5a、CN-B、DVL2、COX-2、VEGF-A、vinculin、vimentin抗體（Abcam公司），二抗為HRP標記的羊抗兔IgG抗體（北京中山生物技術有限公司），Fluo-3/AM（Invitrogen），AEC顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）。

1.1.3 主要設備 RNA定量儀（BECKMAN）、凝膠成像儀（Alphalmager）、PCR儀及電泳、轉膜器材（BIO-RAD）、激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司）

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素細胞分離與培養(yǎng) 取正常男性包皮組織，修剪掉包皮的血塊和皮下脂肪，0.01 mol/L無菌PBS 沖洗3次；置75%乙醇中浸泡50 s；剪成1 cm小長條，置入dispase中，4℃消化16 h；將表皮與真皮分離，將表皮剪碎后置入0.25%胰酶（含0.02% EDTA）中，37 ℃消化 5 min，輕輕吹打5 min，加入含10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化；100目細胞篩網過濾，細胞混懸液1 000 r/min離心7 min，棄上清；用含青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細胞，置入37 ℃、5%CO2孵箱中；2 h后棄上清，用角質細胞培養(yǎng)基K-SFM培養(yǎng)3 d，以抑制成纖維細胞生長；更換含5%胎牛血清的254培養(yǎng)基，以胰酶消化差速貼壁法純化細胞，S-100蛋白、Melan-A鑒定。

1.2.2 RT-PCR 根據Trizol說明書提取4種細胞總RNA。取上述RNA溶液2 μl 稀釋50倍進行定量，A260/ A280值為1.8～2.0。逆轉錄合成cDNA。取上述逆轉錄產物PCR擴增，反應體系為10 μl。反應條件為：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s；51 ℃（CN）、54℃（DVL2）、56℃[Wnt5a、 NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin、vimentin、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]30 s；72 ℃ 30 s；33個循環(huán)；72 ℃ 5 min。產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察結果。以GAPDH（21個循環(huán)）作為內參照，引物設計見表1。

表1 引物設計

1.2.3 Western blot 向大瓶內細胞加入RIPA裂解液，裂解20 min，低溫離心后收集上清液，用BCA法蛋白含量檢測試劑盒定量，取適量總蛋白與其1/4體積5×上樣緩沖液混合后煮沸，配凝膠及電泳，轉膜，用封閉液稀釋一抗（1:1 000兔抗人Wnt5a、DVL2、CN-B、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin、vimentin、?-肌動蛋白）4 ℃過夜，洗膜，用上述封閉液稀釋二抗（1:3 000羊抗兔IgG抗體）室溫2 h，發(fā)光。

1.2.4 正常人黑素細胞和黑素瘤細胞中的Ca2+濃度檢測 常規(guī)傳代，按照每孔4×104的細胞密度將4株細胞放置于激光共聚焦專用的35 mm的細胞培養(yǎng)皿中（皿中間孔直徑為10 mm），加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h；完全貼壁生長后，加入120 μl測定液（Hank's BSS包括20 mmol/L HEPES、10 μmol/L Fluo-3/AM，pH7.4），置培養(yǎng)箱中孵育30 min；用Hank's BSS緩沖液輕洗細胞2次，加入1.5 ml含胎牛血清的DMEM，置培養(yǎng)箱中20 min； 室溫避光20 min，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞熒光，選擇狀態(tài)較好的細胞進行拍攝，結果由Image-Proplus6.0軟件測定光密度值，采用單因素方差分析進行統計學分析，然后采用LSD法進行組間的兩兩比較。

1.2.5 免疫組化染色 常規(guī)脫蠟；滅活內源性過氧化物酶；煮沸修復抗原；加入正常山羊血清封閉液；滴加兔抗人一抗，濕盒中過夜；先后滴加即用型免疫組化ELIVISIONTMPLUS試劑A及B；AEC顯色：棕色EP管先加入850 μl蒸餾水，再先后加入試劑A、B、C各50 μl，搖勻后加至切片室溫顯色，復染后AEC試劑封片。結果判定：利用Image-Pro軟件檢測陽性紅棕色染色面積，＜10%判定為陰性，＞10%判定為陽性，同時在所有陽性標本中，按染色程度分為弱陽性及強陽性[1]。統計學處理采用SAS 9.1.3統計學軟件，χ2檢驗。

2 結 果

2.1 RT-PCR檢測結果

Wnt5a、DVL2、CN-B、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin和vimentin的mRNA在正常黑素細胞中均為低表達，而在原位、侵襲性和轉移性黑素瘤中則有不同程度的高表達，但在不同生長期惡性黑素瘤細胞中并未呈現動態(tài)的變化趨勢（圖1）。

2.2 Western blot檢測結果

內參照β-肌動蛋白相對分子質量為43 000，Wnt5a、DVL2、CN-B、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin和vimentin相對分子質量分別為41 000、93 000、19 000、140 000、78 000、27 000、117 000和57 000。在檢測的4株細胞中，正常人黑素細胞均為低表達，而原位、侵襲性和轉移性黑素瘤細胞的表達均顯著增強，但在不同生長期黑素瘤細胞之間并未呈現出動態(tài)的變化趨勢（圖2）。8個信號分子在mRNA和蛋白質水平的表達均有一致性。

圖1 Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號分子RT-PCR檢測結果

圖2 信號分子的Western-blot檢測結果

2.3 正常黑素細胞及黑素瘤細胞中Ca2+濃度的檢測與正常人黑素細胞相比，WM793B、LIBR和SK-MEL-5細胞內的熒光強度顯著增加，提示黑素瘤細胞內Ca2+濃度明顯增高，但未呈現出由正常皮膚黑素細胞、原位、侵襲性和轉移性黑素瘤細胞內鈣離子濃度逐漸增高的動態(tài)趨勢（圖3）。

2.4 免疫組化檢測不同標本中NFAT 2和CN-B的表達NFAT 2表達于細胞核及細胞質，陽性染色為棕紅色著色顆粒，色素痣中NFAT 2蛋白均為陰性表達（0/30），而不同生長期黑素瘤中NFAT 2蛋白陽性表達率為63%（19/30）（原位、侵襲性和淋巴結轉移黑素瘤組織陽性例數分別為2例、8例和9例；強陽性分別為0例、6例和7例），與色素痣的陰性表達相比，兩者之間差異有統計學意義（P＜0.001）（表2，圖4）。而CN-B主要表達于細胞質。惡性黑素瘤中CN-B蛋白陽性表達率為67%（20/30）（原位、侵襲性和淋巴結轉移黑素瘤組織陽性例數分別為3例、8例和9例；強陽性分別為0例、6例和7例），而在色素痣組織中CN-B蛋白均為陰性表達，兩者之間差異有統計學意義（P＜0.001）（表2，圖5）。

表2 色素痣及黑素瘤組織中NFAT2、CN-B的表達 [例(%)]

圖3 激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞熒光強度

圖4 免疫組化檢測NFAT2表達結果（EliVision法）

圖5 免疫組化檢測CN-B表達結果（EliVision法）

3 討 論

Wnt信號通路是近年來備受關注的調控胚胎發(fā)育和細胞生長、增生和凋亡的信號轉導途徑，非經典Wnt/Ca2+通路在惡性黑素瘤侵襲、轉移中的作用則成為近年來的研究熱點。NFAT是一組在哺乳動物細胞內廣泛表達的轉錄因子，主要參與機體生長發(fā)育和復雜的細胞相互作用，可在轉錄水平上調控細胞周期的演進、生長和分化[2,3]。NFAT對細胞穩(wěn)定具有重要調控作用，這也使其具有致癌的潛能，如在胰腺癌等多種上皮性腫瘤以及腫瘤衍生細胞內均發(fā)現異常的NFAT亞型mRNA和蛋白質表達[4,5]。NFAT的活化途徑為Wnt5a蛋白與細胞表面受體復合物結合后，即觸發(fā)細胞內的信號轉導,活化細胞內蛋白DVL2，繼而促使細胞內Ca2+濃度升高，激活CN，后者使NFAT脫磷酸化，向核轉位，與特定的DNA區(qū)域相結合，調節(jié)COX-2、VEGF、vinculin和vimentin等靶基因的轉錄表達，促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。Juhász 等[6]發(fā)現，黑素瘤細胞系中CN的活性能夠被免疫抑制劑環(huán)孢素(CsA)所抑制，出現細胞代謝活性及增生率降低、細胞形態(tài)學變化、細胞內肌動蛋白結構改變，最后增加死亡率，因而推測CN在黑素瘤細胞的生物學功能方面起著較為重要的作用。Flockhart等[7]發(fā)現，NFAT2及NFAT4表達于黑素瘤細胞系，NFAT作為COX-2的上游調控基因，可調控其蛋白表達及啟動子活性。筆者試驗組的前期研究發(fā)現，COX-2蛋白在惡性黑素瘤細胞系中表達水平明顯升高，COX-2抑制劑塞來昔布和吲哚美辛均能顯著抑制惡性黑素瘤細胞的生長[8]。Wnt5a和Wnt11的基因表達水平在正常黑素細胞中表達較低，而在黑素瘤細胞中有不同程度的升高。利用鈣離子成像技術發(fā)現卡巴膽堿對正常黑素細胞內的鈣離子濃度沒有顯著影響，而不同生長階段的黑素瘤細胞中鈣離子濃度顯著升高[9]。根據文獻報道及筆者前期研究，推測在惡性黑素瘤細胞中可能存在一條Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路，該通路的激活可能參與了黑素瘤的侵襲、轉移過程。為此，筆者首先對不同生長期的黑素瘤細胞中Wnt5a、DVL2、CN、NFAT2、COX-2、VEGF-A、vinculin和vimentin 8個信號分子的mRNA及蛋白質表達進行了檢測，結果為高表達，提示Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路在黑素瘤細胞中被激活。隨后應用激光共聚焦掃描顯微鏡技術對該通路中的重要環(huán)節(jié)——鈣離子濃度進行了檢測，發(fā)現正常黑素細胞中Ca2+濃度較低，但在3株黑素瘤細胞中明顯增高，但信號分子的表達水平和Ca2+濃度在3株黑素瘤細胞之間并未呈現出逐漸增強的動態(tài)變化趨勢，考慮可能選擇的是體外培養(yǎng)的黑素瘤細胞系，而且經過長期的傳代培養(yǎng)，細胞系的某些生物學性狀可能會發(fā)生改變。為驗證Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路在黑素瘤活體組織中是否被激活及其與腫瘤發(fā)展過程的關系，又采用免疫組化對黑素瘤臨床標本中的CN-B和NFAT2進行了檢測，結果顯示色素痣中均為陰性表達，而在黑素瘤組織中CN-B和NFAT2多數呈陽性表達，且侵襲性及轉移性黑素瘤組織中的陽性表達率及表達強度明顯高于原位黑素瘤組織。筆者認為，在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT信號通路可能被激活，并可能參與了黑素瘤的侵襲和轉移過程。

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The expression of signaling molecules of Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT pathway in melanoma

XU Yu-rong，LIU Qi-fang，LIAO Wen-jun
Department of Dermatology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

Objective To investigate the expression of main signaling molecules of Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT signaling pathway in normal melanocytes and melanoma cells. Methods Expression of main signaling molecules was detected by laser confocal, immunohistochemistry, RT-PCR and Western blot in primary cultured melanocytes from healthy persons, WM793B, Libr, Sk-mel-5 melanoma cells, pigmented nevus and melanoma tissue. Results The expression of Wnt5a, DVL2, calcineurin, NFAT2, COX-2, VEGF-A, Vinculin and Vimentin was significantly higher in melanoma cells than in normal melanocytes. The result of Ca2+concentration was similar to the expression of those molecules. The expression of calcineurin-B and NFAT2 was positive in most melanoma tissues but negative in pigmented nevus (P＜0.001). The expression intensity of calcineurin-B and NFAT2 was significantly higher in invasive melanoma and metastatic melanoma than in melanoma in situ. Conclusion The Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT signaling pathway may be activated in melanoma and play a key role in invasion and metastasis of melanoma.

Melanoma；Calcineurin；Nuclear factor of activated T-cells；Wnt5a-Ca2+-CN-NFAT pathway [J Pract Dermatol, 2015, 8(6):406-410]

R739.5

A

1674-1293(2015)06-0406-05

2015-06-28

2015-07-30）

（本文編輯 耿建麗）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20150602

710032 西安，第四軍醫(yī)大學西京皮膚醫(yī)院（徐玉榮，劉啟方，廖文俊）

徐玉榮，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：黑素瘤，E-mail: 1240496856@qq.com

廖文俊，E-mail: liaowj@fmmu.edu.cn