鄭錦芬，石翠萍，賴 維，陸 春

? 論 著 ?

長波紫外線誘導(dǎo)成纖維細胞急性光損傷模型的建立

鄭錦芬，石翠萍，賴 維，陸 春

鄭錦芬

目的 建立長波紫外線（UVA）誘導(dǎo)的成纖維細胞急性光損傷模型。方法 原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞，采用形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光細胞染色對皮膚成纖維細胞進行鑒定，分別用形態(tài)學(xué)觀察、CCK-8法、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色檢測UVA對細胞形態(tài)、增生活性以及細胞衰老狀態(tài)的影響。結(jié)果 UVA劑量 ≤4 J/cm2時對細胞形態(tài)無明顯影響，而UVA劑量≥6 J/cm2時細胞出現(xiàn)變形；UVA劑量≤4 J/cm2時，細胞增生率均＞85%，而UVA劑量≥6 J/cm2時細胞增生率明顯下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）； 4 J/cm2組的衰老陽性細胞明顯增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 4 J/cm2UVA可用于建立人皮膚成纖維細胞急性光損傷模型。

長波紫外線；成纖維細胞；光損傷

[J Pract Dermatol, 2015, 8(6):401-405]

皮膚光老化作為一個獨立的疾病或綜合征已成為國內(nèi)外研究的熱點。到目前為止，皮膚光老化及其相關(guān)疾病的發(fā)病機制仍不清楚。簡單的成纖維細胞是研究皮膚光老化的一個很好模型。單層細胞培養(yǎng)模型則便于紫外線（ultraviolet，UV）照射，由此成為當(dāng)今研究皮膚光老化發(fā)生機制和抗光老化物質(zhì)功效性研究的首選。紫外線按其波長可分為長波紫外線（UVA，320～400 nm）、中波紫外線（UVB，280～320 nm）和短波紫外線（UVC, 200～280 nm）[1]。對皮膚而言，受UV照射影響的主要是UVA和UVB。以往人們認為UVB是引起皮膚光老化的主要類型，然而近年來越來越多的研究證明UVA才是引起皮膚光老化的主要類型[2]。UVA與皮膚光老化密切相關(guān)[3]。然而，到目前為止尚無關(guān)于UVA誘導(dǎo)成纖維細胞急性光損傷模型建立的標準。鑒于此，筆者探討了UVA誘導(dǎo)成纖維細胞急性光損傷模型建立的方法與標準，為研究皮膚光老化發(fā)生機制和抗光老化物質(zhì)功效性研究提供可靠的體外試驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料選用6例6～8歲青少年包皮環(huán)切術(shù)后包皮組織，取包皮組織前已取得患者家屬的知情同意，并經(jīng)過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準[編號：中大附三醫(yī)倫（2010）2-22號]。高糖培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle's media，DMEM）、胰酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、青鏈霉素（美國Gibco公司）；細胞衰老β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色試劑盒（美國Biovision公司）；抗人波形蛋白抗體、抗人纖維連接蛋白抗體、抗人肌間線蛋白抗體、人成纖維細胞表面蛋白抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Abcam公司）；4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、Ⅰ型膠原酶、二甲基亞砜（美國Sigma公司）；CCK-8（cell counting kit-8）試劑（日本Dojindo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 按照文獻[4]中的方法進行培養(yǎng)。以DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中添加胎牛血清（10%）、青霉素（100 U/ml）、鏈霉素（100 μg/ml）。取第3或第4代細胞進行試驗。

1.2.2 成纖維細胞的鑒定 ①形態(tài)學(xué)觀察：取第2或第3代培養(yǎng)的細胞在倒置顯微鏡下觀察并攝像。②免疫熒光細胞染色：待細胞融合＞80%時，調(diào)節(jié)細胞密度為每孔1×104細胞接種于48孔培養(yǎng)板中。無水甲醇固定細胞，加入含1% BSA的磷酸鹽緩沖液（PBS）封閉抗體的非特異性結(jié)合位點，加入一抗，一抗分別為抗人纖維連接蛋白抗體、抗人波形蛋白抗體、抗人成纖維細胞表面蛋白抗體、抗人肌間線蛋白抗體。加入二抗后DAPI染色，在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞染色情況，并攝像。

1.2.3 UVA照 射當(dāng)成纖維細胞生長至80%～90%融 合時，予以UVA照射。UVA光源采用UVA紫外線照射儀（SIGMA SS-03，中國），UVA強度的檢測使用紫外線強度檢測儀（SIGMA，中國）。將細胞用37 ℃預(yù)熱的PBS洗2次。每孔加入等量的薄層PBS，然后用不同劑量的UVA照射。

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察 試驗設(shè)0、2、4、6、8、10 J/cm26個組。取對數(shù)生長的成纖維細胞用0.25%胰酶消化，將細胞以每孔2 ×104細胞的密度接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h后各組予以不同劑量的UVA照射，照射后24 h、48 h和72 h在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并攝像。

1.2.5 細胞增生活性測定 用CCK-8法測定細胞增生率，設(shè)0、 2、4、6、8、10 J/cm26個組，將成纖維細胞按每孔5 ×103細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl含細胞的培養(yǎng)液，每組各設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃孵育4 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定450 nm的吸光度。試驗重復(fù)3次。

1.2.6 SA-β-gal染色 由于形態(tài)學(xué)觀察試驗發(fā)現(xiàn)細胞經(jīng)6 J/cm2UVA照射后出現(xiàn)細胞崩解、死亡，因此本試驗分成0、2、4 J/cm23組。將細胞接種于12孔板中，予以不同劑量的UVA照射，照射后進行SA-β-gal染色。加入預(yù)配好的固定液室溫固定，加入500 μl預(yù)配好的染液，37 ℃孵育過夜。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有試驗重復(fù)至少3次，試驗結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA）。試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成纖維細胞的鑒定

2.1.1 人皮膚成纖維細胞的形態(tài) 顯微鏡下見成纖維細胞形態(tài)多樣，常見的有梭形、多角形和扁平星形。傳代后24 h細胞密度仍較低，此時可見細胞胞體較大，多呈扁平星形和多角形，有較多且較短的突起，胞核也較大。傳代后72 h細胞密度較高，呈魚梭狀排列，細胞多呈梭形或圓形，胞體較小，胞突少而長，胞核較小。傳代后48 h的細胞密度和形態(tài)介于24～72 h（圖1）。

圖1 人皮膚成纖維細胞傳代培養(yǎng)24 h、48 h和72 h的細胞形態(tài)及密度

圖2 人皮膚成纖維細胞在倒置顯微鏡下的表型特征

2.1.2 人皮膚成纖維細胞的表型 圖2所示培養(yǎng)的細胞明顯表達成纖維細胞特異性表面標志，包括纖維連接蛋白、波形蛋白、纖維母細胞表面蛋白和肌間線蛋白。

2.2 成纖維細胞急性光損傷模型的建立

2.2.1 UVA對人皮膚成纖維細胞形態(tài)的影響 與0 J/cm2組相比，2 J/cm2組和4 J/cm2組的細胞在UVA照射后24 h形態(tài)無明顯改變，6 J/cm2組有少部分細胞變形，表現(xiàn)為整個細胞發(fā)生崩解、碎裂，結(jié)構(gòu)被破壞，胞質(zhì)混濁，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多呈顆粒狀，細胞核折光性下降（圖3箭頭所示）。8 J/cm2組孔中央的細胞大部分發(fā)生變形，而10 J/cm2組孔中央的細胞幾乎全部發(fā)生變形，僅孔周圍的細胞形態(tài)正常。UVA照射后48 h 和72 h，與0 J/cm2組相比，2 J/cm2組和4 J/cm2組的細胞形態(tài)均無明顯改變，6 J/cm2組見較多漂浮的死亡細胞，8 J/cm2組 和 10 J/cm2組仍可見較多的變形細胞和漂浮的死亡細胞，變形細胞較24 h減少，正常形態(tài)的細胞較24 h增多。

圖3 不同照射劑量及時間的UVA對人皮膚成纖維細胞形態(tài)的影響（×200）

2.2.2 UVA對皮膚成纖維細胞增生活性的影響UVA照射后24 h，0～10 J/cm2的UVA可呈劑量依賴性抑制細胞增生。UVA劑量≤4 J/cm2時，細胞增生活性均＞85%。而UVA劑量≥6 J/cm2時，細胞存活率明顯下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）（圖4）。

圖4 不同劑量UVA對人皮膚成纖維細胞增生活性的影響

2.2.3 UVA對皮膚成纖維細胞SA-β-gal表達的影響

SA-β-gal染色是目前檢測細胞衰老最常用的方法之一[5]，陽性反應(yīng)者細胞質(zhì)呈藍色。由于前面的形態(tài)學(xué)觀察和細胞增生活性測定發(fā)現(xiàn)UVA≥6 J/cm2時出現(xiàn)細胞變形，且細胞增生率明顯下降，因此本試驗選用≤4 J/cm2UVA劑量檢測UVA對細胞衰老狀態(tài)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 J/cm2組相比，2 J/cm2組SA-βgal染色陽性細胞增加不明顯，而4 J/cm2組的SA-βgal染色陽性細胞則明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）（表1、圖5）。

表1 不同劑量UVA對人皮膚成纖維細胞SA-β-gal表達的影響 （±s）

表1 不同劑量UVA對人皮膚成纖維細胞SA-β-gal表達的影響 （±s）

注：SA-β-gal陽性率=連續(xù)4個視野的陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)；與（0 J/cm2）比較，**P ＜ 0.01

劑量（J/cm2） SA-β-gal染色陽性細胞率（%）0 19.92±7.18 2 20.67±10.06 4 30.21±9.72**

3 討論

皮膚光老化的試驗?zāi)Ｐ桶ㄈ梭w、動物和體外3種模型。在人體上進行的試驗是很有限的，一般只有在不損害人體健康的前提下才能進行人體試驗。因此人們研究光老化的組織學(xué)、生物學(xué)尤其是發(fā)生機制時往往在動物或者體外模型上進行。如今，動物模型和體外模型的研究已經(jīng)取得很大的發(fā)展，成為當(dāng)今研究皮膚光老化的重要工具。光老化動物模型大多采用UV照射的Hr小鼠和豚鼠[6,7]。大量研究證實，成纖維細胞經(jīng)單次或多次照射UVA或者UVB的情況下便能激活光老化相關(guān)的信號通路，并引起老化相關(guān)蛋白的表達，從而奠定了成纖維細胞急性光損傷模型在皮膚光老化研究領(lǐng)域的地位。因此，成纖維細胞急性光損傷模型已成為當(dāng)今研究皮膚光老化發(fā)生機制和抗光老化物質(zhì)功效性研究的首選[8]。

目前，尚無關(guān)于成纖維細胞急性光損傷模型建立的標準。在研究抗光老化物質(zhì)的功效時，人們多采用單次UV照射的方法。由于在過去人們認為UVB是引起皮膚光老化的紫外線光譜，因此過去建立成纖維細胞急性光損傷模型多采用UVB光譜。近年來，人們發(fā)現(xiàn)UVA才是引起皮膚光老化的主要類型[2]，UVB主要與灼傷和皮膚癌有關(guān)，而UVA則與皮膚光老化密切相關(guān)[3]。另外，由于UVB的穿透能力較差，一般無法達到真皮層，而UVA的穿透能力強，可以直達皮膚的真皮層。本文的研究對象成纖維細胞主要存在于真皮層，因此選用UVA照射成纖維細胞建立急性光損傷模型。然而，到目前為止，利用UVA建立成纖維細胞急性光損傷模型的研究甚少，且缺乏統(tǒng)一的模型建立的方法及評價標準。鑒于此，我們探討了UVA誘導(dǎo)的成纖維細胞急性光損傷模型建立的方法與標準，為研究皮膚光老化發(fā)生機制和抗光老化物質(zhì)功效性研究提供可靠的體外試驗?zāi)Ｐ汀?/p>

圖5 不同劑量UVA對人皮膚成纖維細胞SA-β-gal表達的影響

在模型建立過程中，UVA照射劑量是最關(guān)鍵的，也是最難確定的因素。劑量過大容易引起細胞死亡，導(dǎo)致模型建立失敗；劑量太小又不能誘導(dǎo)出典型的光老化生物化學(xué)特征。為了找出一個使細胞產(chǎn)生急性光老化效應(yīng)但又不至于引起細胞明顯死亡的UVA劑量，筆者采用形態(tài)學(xué)觀察、細胞增生活性測定及SA-β-gal染色3種試驗方法共同確定。首先，通過形態(tài)學(xué)觀察初步確定不引起細胞死亡的UVA劑量。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UVA劑量≤4 J/cm2時對細胞形態(tài)無明顯影響，而UVA在劑量≥6 J/cm2時細胞出現(xiàn)變形，表現(xiàn)為整個細胞發(fā)生崩解、碎裂，結(jié)構(gòu)被破壞，胞質(zhì)混濁，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多呈顆粒狀，細胞核折光性下降，漂浮的死亡細胞也明顯增多。該結(jié)果提示UVA≥6 J/cm2時細胞即出現(xiàn)不可逆的死亡。隨后，用CCK-8法檢測了不同劑量UVA對成纖維細胞增生活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成纖維細胞的增生活性隨UVA的劑量升高而降低。UVA在劑量≤4 J/cm2時，細胞增生率均＞85%。而UVA劑量≥6 J/cm2時細胞增生率明顯下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。上述兩個試驗結(jié)果提示UVA≤4 J/cm2時不會引起成纖維細胞明顯死亡。最后，為了在UVA≤4 J/cm2范圍內(nèi)找到一個使細胞產(chǎn)生急性光老化效應(yīng)的劑量，采用SA-β-gal染色檢測UVA對細胞衰老狀態(tài)的改變。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與0 J/cm2組相比，2 J/cm2組SA-β-gal染色陽性細胞增加不明顯，而4 J/cm2組的陽性細胞則明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。因此，4 J/cm2UVA可用于建立人皮膚成纖維細胞急性光損傷模型。

在建立模型時應(yīng)注意以下幾點：①在用UVA照射儀測定UVA強度時，應(yīng)把UVA照射儀放在擬放細胞處測量，否則造成UVA強度的測得值與實際值不符，因為UVA強度在UVA燈管下的不同位置而不同，即細胞所在位置的UVA強度與UVA燈管與細胞間的垂直距離呈負相關(guān)。為了保證試驗的可重復(fù)性，細胞的放置位置及UVA燈管與細胞的放置位置間的垂直距離應(yīng)固定，使其成為不變（固定）因素。根據(jù)公式：紫外線的有效劑量=紫外線的有效照射強度×被照射的時間。將細胞所受到的有效照射強度設(shè)定成固定因素，便可通過調(diào)整照射時間隨機調(diào)整UVA照射劑量。② UVA對細胞的生物學(xué)效應(yīng)不僅與UVA的劑量有關(guān)，也與PBS的量（高度）密切有關(guān)。在UVA照射細胞時需用PBS溶液代替DMEM培養(yǎng)基，防止后者中的成分對UVA的吸收作用或者遮擋作用。雖然PBS溶液是透明的，但是在試驗中發(fā)現(xiàn)其對UVA仍有遮擋作用，從而影響了細胞對UVA的生物學(xué)效應(yīng)。例如，在6孔培養(yǎng)板的不同孔中加入不等量的PBS溶液，細胞照射等劑量的UVA后，PBS量少的孔成纖維細胞更易出現(xiàn)形態(tài)改變及死亡，而PBS量多者則不容易出現(xiàn)上述改變。因此，為了保證各試驗組所照射的UVA劑量是等同的，必須使各試驗組的PBS量（高度）相同。同時，根據(jù)試驗?zāi)康男枰鼡Q底面積不同的培養(yǎng)皿時，需要根據(jù)新舊培養(yǎng)皿底面積之間的倍比關(guān)系換算新培養(yǎng)皿所需的PBS量，以保證PBS的高度不變。由此可見，人皮膚成纖維細胞急性光損傷模型的建立是整個試驗條件體系的建立，而不僅僅是UVA劑量這一單純因素的確立。

本研究的目的是建立人皮膚成纖維細胞急性光損傷模型，為此，需找出一個使細胞產(chǎn)生急性光損傷效應(yīng)但又不至于引起細胞明顯死亡的UVA劑量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)UVA= 4 J/cm2時細胞未見形態(tài)改變且細胞存活率在85%以上，并可誘導(dǎo)細胞衰老。這說明我們所建立的人皮膚成纖維細胞急性光損傷模型是成功的。

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Establishment of fibroblast model of acute photodamage

ZHENG Jin-fen，SHI Cui-ping，LAI Wei，et al
Department of Dermatology, Shenzhen Center for Chronic Disease Control and Prevention, Shenzhen 518020, China

Objective To establish the fibroblast model of acute photodamage. Methods Primary human dermal fibroblasts were cultured and identified by morphology and immunofluorescence staining. The cellular morphology, viability, cellular senescent state of the UVA-exposed fibroblasts were analyzed by morphology, CCK-8 and senescence associated-β-galactosidase(SA-β-gal) staining, respectively. Results Our experiment showed that UVA, with the doses less than 4 J/cm2, did not change the morphology of the fibroblasts and resulted in more than 85% viable cells. However, the cellular morphology was changed when the cells exposed to UVA with the doses of 6 J/cm2or greater. In addition, compared to the control group, the viable cells were decreased significantly (P＜0.01) when the cells were irradiated by UVA with the doses of 6 J/cm2or greater. The group irradiated by UVA with 4 J/cm2had significantly more (P＜0.01) SA-β-gal positive cells compared to the control group. Conclusion The 4 J/cm2of UVA could be used to establish the fibroblast model of acute photodamage.

Ultraviolet A；Fibroblast；Photodamage

R454.2；R329.27

A

1674-1293(2015)06-0401-05

2015-05-25

2015-09-04）

（本文編輯 耿建麗）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20150601

中華醫(yī)學(xué)會-歐萊雅中國人健康皮膚研究項目（編號：S2011080801）；深圳市醫(yī)療衛(wèi)生類科研項目（編號：201303108）

518020 深圳，深圳市慢性病防治中心（鄭錦芬）；暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院（石翠萍）；中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院（賴維，陸春）

鄭錦芬，博士，主治醫(yī)師，研究方向：皮膚老化的分子生物學(xué)機制，E-mail: zhengjinfen@aliyun.com