王興亮 劉娟 費忠亭 高愛忠 陳震 劉興祥

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·論著·

全血γ-干擾素釋放試驗在繼發(fā)性肺結(jié)核中的輔助診斷價值

王興亮 劉娟 費忠亭 高愛忠 陳震 劉興祥

目的 研究分析全血γ-干擾素釋放試驗(the whole blood interferon gamma release assay in vitro，IGRA-ELISA)在繼發(fā)性肺結(jié)核中的輔助診斷及臨床應(yīng)用價值。方法 前瞻性納入2012年8月至2013年6月淮安市第四人民醫(yī)院143例疑似活動性肺結(jié)核患者，包括110例活動性肺結(jié)核患者，其中繼發(fā)性肺結(jié)核66例，和33例非結(jié)核病患者進行IGRA-ELISA、結(jié)核抗體、抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測。采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 在繼發(fā)性肺結(jié)核中，IGRA-ELISA敏感度為90.9%(60/66)，均高于結(jié)核抗體檢測(57.6%，38/66)、抗酸染色檢測(16.7%，11/66)，且IGRA-ELISA與另兩種方法敏感度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.588,P=0.000；χ2=1.320，P=0.000；χ2=6.005，P=0.000)。特異度方面3種檢測方法均在90%以上，分別為93.9%(31/33)，93.9%(31/33)，90.9%(30/33)，IGRA-ELISA、結(jié)核抗體與抗酸染色檢測方法特異度兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.220，P=1.000；χ2=4.311，P=1.000；χ2=0.213，P=1.000)。細菌培養(yǎng)陽性的繼發(fā)性肺結(jié)核患者中，IGRA-ELISA陽性率為96.0%(24/25)，而培陰的繼發(fā)性肺結(jié)核患者中IGRA-ELISA陽性率為87.8%(36/41)。結(jié)論 相比其他檢測方法，IGRA-ELISA在繼發(fā)性肺結(jié)核診斷中的敏感度和特異度最高，可作為繼發(fā)性肺結(jié)核輔助診斷的有效依據(jù)，尤其是培陰繼發(fā)性肺結(jié)核患者的輔助診斷。

干擾素γ釋放試驗； 結(jié)核, 肺/診斷； 酶聯(lián)免疫吸附測定； 敏感性與特異性

《2014年全球結(jié)核病報告》顯示：2013年全球有900萬例結(jié)核病新發(fā)患者， 150萬例死亡。中國是結(jié)核病的高發(fā)區(qū)，結(jié)核病發(fā)病例數(shù)居全球第二?！?010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告》估算，全國有600萬例活動性肺結(jié)核患者，且患者例數(shù)逐年增加，形勢依然嚴峻[1]。

繼發(fā)性肺結(jié)核是我國肺結(jié)核的主要發(fā)病類型，是由于結(jié)核分枝桿菌再次感染而導(dǎo)致的肺結(jié)核，此類病變常常始于肺尖，形成再感染灶，多數(shù)是患者體內(nèi)之前潛伏的結(jié)核分枝桿菌復(fù)燃，少數(shù)為患者再次感染外源性結(jié)核分枝桿菌。繼發(fā)性肺結(jié)核易形成干酪樣壞死和空洞，排菌者較多，在流行病學(xué)上具有重要意義。

目前對于繼發(fā)性肺結(jié)核的診斷主要有影像學(xué)、細菌學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)方法。從病理學(xué)和影像學(xué)形態(tài)特點可對繼發(fā)性肺結(jié)核進行細致的區(qū)分，對鑒別診斷有一定幫助，但對治療意義不大，且病理學(xué)檢查需要進行創(chuàng)傷性取樣；痰涂片敏感度低，細菌培養(yǎng)時間周期過長，制約著結(jié)核病診斷的有效性和時效性；核酸檢測等技術(shù)由于成本和技術(shù)的復(fù)雜性等問題使其在醫(yī)學(xué)檢驗實驗室較難展開；傳統(tǒng)的結(jié)核菌素試驗的結(jié)果不能夠區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌感染和卡介苗接種[2-4]，故尋找一種準確、快速、可靠的方法診斷繼發(fā)性結(jié)核病十分重要。

材料和方法

一、患者來源和分組

前瞻性納入2012年8月至2013年6月在淮安市第四人民醫(yī)院門診及住院診治的疑似活動性肺結(jié)核患者共143例，男101例，女42例，年齡中位數(shù)43歲。

(一)繼發(fā)性肺結(jié)核組患者入組標準與一般情況介紹

1．入組標準：(1)感染過結(jié)核分枝桿菌，結(jié)核病第2次暴發(fā)；(2)胸片在肺上葉尖后段、肺下葉背段等處呈多種混合形態(tài)(同時呈現(xiàn)滲出、增殖、纖維和干酪性病變)等有繼發(fā)性肺結(jié)核的疑似特征；(3)痰培養(yǎng)陽性，或痰培養(yǎng)陰性但患者有活動性肺結(jié)核的癥狀和體征，且臨床診斷性抗結(jié)核治療有效。滿足上述2條以上則診斷為繼發(fā)性肺結(jié)核組。

2.一般情況介紹：入組活動性肺結(jié)核組的患者110例，其中繼發(fā)性肺結(jié)核66例，占肺結(jié)核患者60.0%(66/110)；男性占81.8%(54/66)。從年齡分布來看，未成年人占6.1%(4/66)；青壯年占78.8%(52/66)；老年人占15.2%(10/66)。

(二)非結(jié)核病組患者入組標準與一般情況介紹

1.入組標準：臨床表現(xiàn)明確系其他疾病所致的，或者經(jīng)其他治療(未經(jīng)抗結(jié)核治療)病情改善的。

2.一般情況介紹：入組非結(jié)核病組的患者共計33例，男性15例，女性18例，具體分組及各組年齡組成見表1。

二、試劑和儀器

改良羅氏培養(yǎng)基(上海伊華科學(xué)技術(shù)有限公司出品)，高壓滅菌后的4%氫氧化鈉(NaOH)溶液，生理鹽水，結(jié)核感染T細胞檢測試劑盒(體外釋放酶聯(lián)免疫法)(IGRA-ELISA)(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司出品)，結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒(膠體金法)(上海奧普生物醫(yī)藥有限公司出品)，抗酸染色試劑(珠海貝索生物技術(shù)有限公司出品)；離心機(TDZ5B-WS，上海盧湘儀公司出品)、恒溫培養(yǎng)箱(HH-420，上海喬躍電子有限公司出品)、酶標儀[IMARK，美國伯樂(Bio-Rad)公司出品]

三、檢測方法

1.結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)：樣本先用4% NaOH溶液進行預(yù)處理，后棄去上清，沉淀中加入0.9%的生理鹽水，顛倒混勻后1500×g離心10 min，重復(fù)該操作2次；之后沉淀混勻后取100 μl無菌接種在改良羅氏培養(yǎng)基上，37 ℃平臥放置斜面24 h；然后，擰緊培養(yǎng)瓶蓋，直立放置繼續(xù)培養(yǎng)。每周觀察1次菌落生長情況，做好記錄，有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認是否為抗酸桿菌。若至第8周仍無菌落生長，方可報告陰性結(jié)果。

2.IGRA-ELISA：取肝素抗凝血4 ml，在2 h內(nèi)分裝至陰性對照管N、檢測管T、陽性對照管P，3種培養(yǎng)管中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(22±2) h，1500×g離心10 min，取血漿進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測。具體檢測操作按試劑說明書進行(雙抗體夾心法)。

表1 兩組患者性別與年齡分布(例)

3.結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(膠體金法)：在反應(yīng)板的反應(yīng)孔中間，加入2滴封閉液(20%山羊血清和pH 7.4磷酸鹽緩沖)，取40 μl新鮮的血清標本，加入反應(yīng)孔中間，再在反應(yīng)孔中間加入6滴洗滌液(0.1%吐溫和pH 7.4磷酸鹽緩沖液)、2滴金標液(膠體金綴合物)、6滴洗滌液(0.1%吐溫和pH 7.4磷酸鹽緩沖液)，等待薄膜吸入，目測判讀結(jié)果。具體檢測操作按結(jié)核抗體試劑說明書進行。

4.抗酸染色檢測：在涂片標本上先滴加石炭酸復(fù)紅進行初染，再用3%鹽酸酒精脫色，之后用堿性美藍溶液復(fù)染，水洗后用吸水紙吸干后觀察。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3種結(jié)核病診斷檢測方法的比較

對入組患者行IGRA-ELISA、結(jié)核抗體、抗酸染色3種檢測。在繼發(fā)性肺結(jié)核組中，IGRA-ELISA、結(jié)核抗體、抗酸染色檢測敏感度分別為90.9%(60/66)、57.6%(38/66)、16.7%(11/66)，具體見表2。

對非結(jié)核病組進行3種方法檢測，分別是IGRA-ELISA、結(jié)核抗體、抗酸染色檢測特異度分別為93.9%(31/33)、93.9%(31/33)、90.9%(30/33)，具體見表2。

表2 3種檢測方法在2組患者中的結(jié)果比較

注 (1) IGRA-ELISA與結(jié)核抗體敏感度比較，χ2=1.588,P=0.000; (2) IGRA-ELISA與抗酸染色敏感度比較，χ2=1.320,P=0.000; (3) 結(jié)核抗體與抗酸染色敏感度比較，χ2=6.005,P=0.000; (4) IGRA-ELISA與結(jié)核抗體特異度比較，χ2=7.220,P=1.000; (5) IGRA-ELISA與抗酸染色特異度比較，χ2=4.311,P=1.000; (6) 結(jié)核抗體與抗酸染色特異度比較，χ2=0.213,P=1.000

二、IGRA-ELISA與細菌培養(yǎng)檢測結(jié)果的比較

細菌培養(yǎng)陽性而確定的繼發(fā)性肺結(jié)核有25 例，占繼發(fā)性肺結(jié)核的37.9%(25/66)。細菌培養(yǎng)陽性的繼發(fā)性肺結(jié)核患者采用IGRA-ELISA技術(shù)檢測的陽性率達到96.0%(24/25)，而細菌培養(yǎng)陰性的繼發(fā)性肺結(jié)核患者41例采用IGRA-ELISA技術(shù)檢測的陽性率也達到了87.8%(36/41)。

討 論

結(jié)核病被列為我國重大傳染病之一，是嚴重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病，僅活動性結(jié)核病患病率就高達367/10萬例，但結(jié)核病檢出率僅為39%[2]。因此通過快速診斷活動性結(jié)核病是結(jié)核病預(yù)防控制項目的重點，但已有的常規(guī)檢測很難達到這一點[3]，傳統(tǒng)的結(jié)核菌素皮膚試驗特異度差，外加對于免疫抑制的患者缺乏足夠的敏感度而導(dǎo)致假陰性。近年來，研究表明全血γ-干擾素釋放試驗在檢測在活動性肺結(jié)核、肺外結(jié)核的敏感度、特異度優(yōu)于結(jié)核菌素試驗[4-7]。

一、IGRA-ELISA技術(shù)檢測原理

本研究所采用的IGRA-ELISA技術(shù)，其原理是利用結(jié)核分枝桿菌特有的基因RD1區(qū)域編碼的2個特異性蛋白早期分泌靶抗原-6(early secretory antigenic target-6，ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白-10(culture filtrate protein-10，CFP-10)作為刺激抗原誘導(dǎo)全血標本中結(jié)核抗原特異性記憶T淋巴細胞產(chǎn)生特異的免疫應(yīng)答，間接檢測應(yīng)答所產(chǎn)生的γ-干擾素(IFN-γ)，國內(nèi)外已有文獻報道其靈敏度和特異度強[5-8]。由于IGRA-ELISA技術(shù)檢測的是T細胞介導(dǎo)的IFN-γ反應(yīng)，因此不僅可檢測肺結(jié)核，同時適用于肺外結(jié)核檢測?；贗GRA-ELISA技術(shù)在敏感度和特異度上的優(yōu)勢，近年來，大量具有相同原理的技術(shù)在歐盟、美國等發(fā)達國家獲得批準，并作為結(jié)核感染篩查和結(jié)核潛伏感染篩查的重要檢測手段[5-6,9]。本研究所用的IGRA-ELISA技術(shù)是已在國內(nèi)獲得批準的應(yīng)用于全血γ-干擾素釋放試驗的檢測技術(shù)。

二、IGRA-ELISA技術(shù)在繼發(fā)性肺結(jié)核中的檢測結(jié)果分析

本研究將IGRA-ELISA技術(shù)應(yīng)用于繼發(fā)性肺結(jié)核檢測中，以觀察其輔助檢測性能。以繼發(fā)性肺結(jié)核患者為對象，對IGRA-ELISA技術(shù)與結(jié)核抗體、抗酸染色檢測方法進行比較， IGRA-ELISA技術(shù)的敏感度(90.9%，60/66)明顯高于結(jié)核抗體(57.6%，38/66)和抗酸染色(16.7%，11/66)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.588,P=0.000；χ2=1.320，P=0.000，χ2=6.005，P=0.000，)，IGRA-ELISA技術(shù)的敏感度同時也高于結(jié)核病檢測的金標準——細菌培養(yǎng)(37.9%，25/66)的檢出率，提示IGRA-ELISA技術(shù)檢測繼發(fā)性肺結(jié)核的敏感度高；而對非結(jié)核病組檢測時，幾種檢測方法特異度均在90%以上。另外，IGRA-ELISA技術(shù)檢測菌陽的繼發(fā)性肺結(jié)核患者的陽性率為96.0%(24/25)，而對菌陰繼發(fā)性肺結(jié)核檢測的陽性率為87.8%(36/41)：IGRA-ELISA檢測在繼發(fā)性肺結(jié)核中具有較高的敏感度和特異度，與國內(nèi)外報道一致[10-12]，提示其對繼發(fā)性肺結(jié)核的輔助診斷具有重要意義，尤其是在細菌培養(yǎng)陰性的繼發(fā)性肺結(jié)核患者的輔助診斷上。

抗酸染色檢測是世界范圍內(nèi)結(jié)核病檢查中使用最廣泛的技術(shù)，局限性在于敏感度差，受痰樣本和病情的影響，同時抗酸染色陽性中約12%是由于非結(jié)核分枝桿菌引起[1]。本研究中抗酸染色敏感度僅為16.7%，遠低于文獻報道的50%～60%[13]，特異度則高達90.9%，可能與入選的患者樣本有關(guān)。

同時，筆者在臨床中總結(jié)發(fā)現(xiàn)：結(jié)核分枝桿菌感染機體，患者血清中有特異性抗體形成，檢測抗體對結(jié)核病有輔助診斷價值，但無論是對肺結(jié)核還是肺外結(jié)核的診斷，現(xiàn)有的商品化血清學(xué)檢測方法均未達到理想的診斷效果，并且在不同人群和地區(qū)存在較大的差異性。細菌培養(yǎng)常作為結(jié)核病檢測的金標準，但其敏感度較低，且培養(yǎng)周期較長。IGRA-ELISA技術(shù)在該研究中相比其他方法，特異度一致，敏感度遠高于其他方法，有明顯的優(yōu)勢，這是與該方法細胞免疫的原理及技術(shù)平臺相匹配的。

IGRA-ELISA技術(shù)在繼發(fā)性肺結(jié)核檢測中表現(xiàn)出良好的檢測結(jié)果，且具有操作簡單方便的特點，適合臨床作為繼發(fā)性肺結(jié)核檢測的輔助診斷工具。

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(本文編輯：王然 薛愛華)

Auxiliary diagnostic value of the whole blood gamma release assay in vitro for secondary pulmonary tuberculosis

WANG Xing-liang, LIU Juan, FEI Zhong-ting, GAO Ai-zhong, CHEN Zhen, LIU Xing-xiang.

Medical Testing Center，Huai’an No. 4 People’s Hospital, Jiangsu 223300, China

LIU Xing-xiang，Email：halxx@163.com

Objective To evaluate the auxiliary diagnostic value of the whole blood interferon gamma release assay in vitro (IGRA-ELISA) in the patients with secondary pulmonary tuberculosis (TB). Methods One hundred and forty three cases of suspected patients with active pulmonary TB, from August in 2012 to June in 2013 in Huai’an No. 4 People’s Hospital, were divided into groups and examined with IGRA-ELISA test, anti-TB antibody test, sputum smear and mycobacterial culture. There were 110 cases with active pulmonary TB (including 66 cases with secondary pulmonary TB), and 33 cases with nonTB disease-. SPSS 18.0 was used for statistical analysis, the chi square test was used for counting data, andP<0.05 was statistically significant. Results Of the patients with secondary pulmonary TB, the sensitivity of the IGRA-ELISA test (90.9%, 60/66) was the highest of among the three tests,the sensitivities of anti-TB antibody test and sputum smear were 57.6% (38/66) and 16.7% (11/66), respectively. They were dramatically different (χ2=1.588,P=0.000；χ2=1.320，P=0.000，χ2=6.005，P=0.000)．The specificities of all the three tests were over 90% (93.9%, 31/33; 93.9%, 31/33; 90.9%, 30/33), and there were no great difference (χ2=7.220，P=1.000；χ2=4.311，P=1.000，χ2=0.213，P=1.000). The positive rates of IGRA-ELISA in culture-positive and culture-negative patients with the secondary pulmonary TB were 96.0% (24/25) and 87.8% (36/41), respectively. Conclusion Compared with other methods, the IGRA-ELISA test enjoyed the highest sensitivity and specificity in clinical application. It could be used as an auxiliary diagnostic method for the secondary pulmonary TB, especially in culture-negative pulmonary TB.

Interferon-gamma release tests； Tuberculosis, pulmonary/diagnosis; Enzyme-linked immunosorbent assay； Sensitivity and specificity

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.010

223300 江蘇省淮安市第四人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心(王興亮、劉娟、劉興祥)，結(jié)核科(費忠亭、高愛忠、陳震)

劉興祥，Email：halxx@163.com

2015-02-13)