黃毅 黨麗云 郭琪 張耀輝 謝琨 王龍智

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·論著·

全血γ-干擾素釋放試驗對結(jié)核病與惡性腫瘤患者檢測結(jié)果的比較研究

黃毅 黨麗云 郭琪 張耀輝 謝琨 王龍智

目的 對結(jié)核病、惡性腫瘤患者的全血γ-干擾素釋放試驗檢測結(jié)果進行比較，分析其臨床意義。方法 搜集2014年3月至2014年12月就診于西安市結(jié)核病胸部腫瘤醫(yī)院的結(jié)核病、肺炎、惡性腫瘤164例患者，以及同期來我院進行健康體檢的人員50名。其中結(jié)核病組患者51例，惡性腫瘤組72例，肺炎組41例，健康對照組50例。所有研究對象均采用海口維瑅璦生物研究院結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒。所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果 各組全血γ-干擾素釋放試驗的檢測陽性率分別為結(jié)核病組98.0%(50/51)、惡性腫瘤組50.0%(36/72)、肺炎組29.3%(12/41)、健康對照組8.0%(4/50)。與健康對照組相比，結(jié)核病組、惡性腫瘤組和肺炎組患者的全血γ-干擾素釋放試驗檢測陽性率均較高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為82.26、23.62、7.03，P值均<0.05)。各類惡性腫瘤患者之間全血γ-干擾素釋放試驗檢測的陽性率均相似，分別為：肺腺癌組54.8%(17/31)；肺鱗癌組38.9%(7/18)；小細胞肺癌組40.0%(4/10)；其他惡性腫瘤組61.5%(8/13)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.27，P>0.05)。結(jié)論 ?？诰S瑅璦全血γ-干擾素釋放試驗試劑盒對結(jié)核病診斷的敏感度很高，但特異度較低；在惡性腫瘤患者中的檢測陽性率也較高，其原因有待進一步研究。

結(jié)核/診斷; 癌; 干擾素γ釋放試驗; 酶聯(lián)免疫吸附測定

γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assays，IGRAs)是近年來發(fā)展起來的用于檢測結(jié)核感染的一種新方法，根據(jù)檢測方法和原理不同分為2種：一種是IGRAs檢測以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測平臺為主，即通過 ELISA 試驗定量檢測全血中γ-干擾素的釋放水平(簡稱“全血γ-干擾素釋放試驗”或“IGRA-ELISA技術(shù)”)；另外一種是通過酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)對體外特異性免疫應答的T淋巴細胞進行計數(shù)來定量分析[簡稱“結(jié)核感染T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗(T-SPOT.TB)”]。目前，IGRAs技術(shù)已經(jīng)被作為一種診斷結(jié)核病的工具應用于臨床。國內(nèi)外文獻報道IGRAs對于診斷結(jié)核病，尤其是診斷潛伏性結(jié)核感染具有很高的敏感度和特異度[1]。我國是結(jié)核病高發(fā)國家，是世界上結(jié)核病22個高負擔國之一，占全球總負擔的15%[2]；但是目前也有文獻報道，在我國這種結(jié)核高感染率的背景下，應用T-SPOT.TB技術(shù)檢測肺癌患者，其部分患者的檢測結(jié)果呈陽性表現(xiàn)[3]。本研究通過分析IGRA-ELISA技術(shù)在結(jié)核病組、惡性腫瘤組、肺炎組和健康對照組中的陽性率比較，旨在為減少臨床工作中的誤診，為患者的診斷提供一定的幫助，現(xiàn)將具體研究結(jié)果報道如下。

對象和方法

一、研究對象

搜集2014年3月至2014年12月就診于西安市結(jié)核病胸部腫瘤醫(yī)院的結(jié)核病、肺炎、惡性腫瘤164例患者，以及同期來我院進行健康體檢的人員50名。所有研究對象均采用IGRA-ELISA技術(shù)進行檢測。其中，結(jié)核病組患者51例，惡性腫瘤組患者72例，肺炎組患者41例，健康對照組受檢者50名。所有受試者年齡均>18歲，且排除合并免疫性疾病。

結(jié)核病組和惡性腫瘤組所有受調(diào)查對象均進行血液結(jié)核抗體檢驗、濃縮集菌抗酸菌檢測、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、痰結(jié)核分枝桿菌核酸檢測。

結(jié)核病組：所有的患者都為經(jīng)病理確診或細菌學確診的初治結(jié)核病患者，且在進行IGRA-ELISA技術(shù)檢測前均未開始抗結(jié)核治療?；颊咧形荒挲g為41歲。

惡性腫瘤組：所有的腫瘤患者均為初次診斷、病理確診，且結(jié)核感染相關(guān)檢測(PPD、結(jié)核抗體、PCR、RNA、濃縮集菌抗酸菌檢測、痰培養(yǎng))均為陰性，患者中位年齡為52歲。其中，肺腺癌31例，肺鱗癌18例，小細胞肺癌10例，其他惡性腫瘤(包括淋巴瘤、小細胞肝癌、腎癌等)13例。

肺炎組：所有患者均為不支持肺結(jié)核和肺部腫瘤的肺炎患者，患者中位年齡38歲。

健康對照組：電腦數(shù)字表法隨機抽取2014年3—12月在我院體檢人群，排除不合格者及影像學、實驗室檢查或臨床表現(xiàn)提示有活動性病變者，中位年齡為44歲。

所有受調(diào)查對象均簽署知情同意書，并獲得西安市結(jié)核病胸部腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準。

二、研究方法

所有參與調(diào)查分析的對象均采用IGRA-ELISA技術(shù)進行檢測，并對不同組別的檢測陽性率進行分析比較。所用試劑為?？诰S瑅璦生物研究院出品的結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)。

具體試驗方法：分為全血刺激和γ-干擾素檢測2個步驟。無菌采集全血(肝素鈉或肝素鋰抗凝)，且每份標本的總血量不少于3 ml。于2 h內(nèi)分裝于N(表示陰性對照管)、P(表示陽性對照管)和T(表示檢測管)3個反應管內(nèi)，分別加入陰性刺激劑、陽性刺激劑和含特異性蛋白抗原[培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)和早期分泌靶抗原6(ESAT-6)]的刺激劑，迅速顛倒混勻，37 ℃水浴24 h。培養(yǎng)后的培養(yǎng)管以1980×g離心5 min，取離心上清液進行ELISA檢測，在450 nm處測定其吸光度值(A值)；依據(jù)試劑盒中校準品所作標準曲線及標準曲線方程，依據(jù)各反應管內(nèi)的A值得出γ-干擾素的濃度值(IU/ml)。

結(jié)果判讀：當N<0.5 IU/ml時，(T-N)/(P-N)≥0.6時判為陽性，否則為陰性；當N≥0.5 IU/ml時，(T-N)/(P-N)≥0.85時判為陽性，否則為陰性；且當P-N≥10 IU/ml時，按P-N=10 IU/ml計算。

三、統(tǒng)計學分析方法

計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計結(jié)果由SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。

結(jié) 果

一、 IGRA-ELISA技術(shù)檢測結(jié)果

結(jié)核病組、惡性腫瘤組、肺炎組、健康對照組的IGRA-ELISA技術(shù)檢測結(jié)果陽性率分別為98.0%(50/51)、50.0%(36/72)、29.3%(12/41)、8.0%(4/50)。各患者組和健康對照組陽性率相比較差異均有統(tǒng)計學意義；惡性腫瘤組與肺炎組的陽性率比較，差異也有統(tǒng)計學意義。IGRA-ELISA技術(shù)在本研究中診斷結(jié)核病的敏感度和特異度分別為98.0%(50/51)、68.1%(111/163)(表1)。

二、不同惡性腫瘤患者進行IGRA-ELISA技術(shù)檢測的結(jié)果比較

在不同腫瘤組別之間，IGRA-ELISA技術(shù)檢測的陽性率差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

表1 不同組別IGRA-ELISA技術(shù)檢測結(jié)果的比較

注 結(jié)核病組與健康對照組比較，χ2=82.26，P=0.001；惡性腫瘤組與健康對照組比較，χ2=23.62，P=0.001；肺炎組與健康對照組比較，χ2=7.03，P=0.008；惡性腫瘤組與肺炎組比較，χ2=4.59，P=0.032；計算特異度時將結(jié)核病外的其他組檢測陽性視為假陽性(對于可能存在的潛伏結(jié)核感染已進行結(jié)核感染相關(guān)檢測均為陰性，在此忽略不計)

表2 不同類別惡性腫瘤患者IGRA-ELISA技術(shù)檢測結(jié)果比較

討 論

一、IGRAs診斷原理

目前，IGRAs被認為是結(jié)核分枝桿菌感染的診斷技術(shù)。這項技術(shù)的原理是機體感染結(jié)核分枝桿菌后，血液中的記憶性T淋巴細胞和單核細胞會再次接觸結(jié)核分枝桿菌特異性抗原時產(chǎn)生和分泌相應的細胞因子(即γ-干擾素)。所以，該實驗技術(shù)選取了存在于結(jié)核分枝桿菌但在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中普遍缺少的RD1區(qū)編碼的ESAT-6和CFP-10蛋白作為刺激抗原，刺激受檢者外周血中的T淋巴細胞，通過定量檢測γ-干擾素含量或計數(shù)分泌γ-干擾素的T淋巴細胞數(shù)量來判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌特異性活化的效應T細胞，從而判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌感染[5-8]。

二、IGRAs檢測技術(shù)的敏感度和特異度

結(jié)合IGRAs技術(shù)原理及目前文獻報道、臨床分析等，IGRAs對于結(jié)核病的診斷具有較高敏感度和特異度。國外文獻報道顯示，在活動性肺結(jié)核患者中IGRA-ELISA技術(shù)的整體敏感度為81%，特異度為95%[9]。本研究的結(jié)果顯示，IGRA-ELISA技術(shù)對于診斷結(jié)核病的敏感度和特異度分別為98.0%和68.1%，其敏感度高于國外文獻報道，而特異度偏低，其原因可能在于：(1)與本實驗所采用的試劑盒所設定的臨界值(cut-off值)偏低有關(guān)。(2)與本研究計算特異度時將結(jié)核病組之外的另外3組中可能存在的結(jié)核分枝桿菌隱性感染者作為假陽性有關(guān)。

三、惡性腫瘤患者IGRA-ELISA檢測結(jié)果陽性原因分析

目前，未發(fā)現(xiàn)IGRA-ELISA技術(shù)在惡性腫瘤患者中應用的研究報告。本研究采用國產(chǎn)IGRA-ELISA試劑，在惡性腫瘤中其陽性率為50.0%(36/72)，高于劉旭輝等[3]報道的T-SPOT.TB檢測在肺癌患者的陽性率[27.3%(6/22)]，其原因可能與樣本量及方法學不同，或者是本研究所選取的腫瘤患者存在潛伏結(jié)核感染有關(guān)；本研究中惡性腫瘤組IGRA-ELISA技術(shù)的檢測陽性率顯著高于健康對照組的陽性率，與劉旭輝等[3]的報道基本一致。同時，本研究進一步對不同類別肺部惡性腫瘤進行分層研究，結(jié)果顯示IGRA-ELISA技術(shù)檢測對于不同類別惡性腫瘤[肺腺癌、肺鱗癌、小細胞肺癌、其他惡性腫瘤(如淋巴瘤、小細胞肝癌、腎癌等)]的診斷敏感度均相似，差異無統(tǒng)計學意義，說明腫瘤類別對該技術(shù)檢測結(jié)果無顯著影響。

結(jié)合文獻報道分析研究結(jié)果，惡性腫瘤患者其IGRA-ELISA技術(shù)的檢測陽性率較肺炎組及健康對照組高可能與下列因素有關(guān)：(1)我國是結(jié)核感染的高負擔國家，惡性腫瘤患者IGRA-ELISA技術(shù)檢測陽性可能與腫瘤患者免疫力低下更容易合并潛伏結(jié)核感染有關(guān)。(2)腫瘤效應T淋巴細胞的存在：腫瘤形成過程中，機體會產(chǎn)生抗腫瘤免疫，這種抗腫瘤免疫主要由T淋巴細胞所介導，其基礎(chǔ)是CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTLs)和CD4+1型輔助性T細胞(Th1)所介導的1型適應性免疫應答。免疫記憶是適應性免疫應答的重要特征之一，而效應性T淋巴細胞是記憶T淋巴細胞的主要組成[10-12]。這與機體在初次感染結(jié)核分枝桿菌后產(chǎn)生的記憶性T淋巴細胞主要為CD4+、CD8+T淋巴細胞[13]具有相似的機制。所以，在腫瘤形成過程中是否會產(chǎn)生某種同源效應性T淋巴細胞在受到ESAT-6和CFP-10蛋白刺激后釋放γ-干擾素，從而表現(xiàn)為IGRA-ELISA檢測結(jié)果陽性？綜上所述，使用?？诰S瑅璦生物研究院結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒的IGRA-ELISA法敏感度較高，但特異度一般，對于惡性腫瘤患者不能確定是其否存在結(jié)核分枝桿菌感染。本研究結(jié)果提示IGRA-ELISA在惡性腫瘤患者中檢測陽性率較高這一現(xiàn)象，還需進一步擴大惡性腫瘤組患者的樣本量并且進行深入的機制研究來驗證。

[1] Lalvani A. Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century: new tools to tackle an old enemy. Chest, 2007, 131(6): 1898-1906.

[2] 龍云江. 淺談結(jié)核病防制的健康教育. 中國醫(yī)藥指南, 2011, 9(19): 174-175.

[3] 劉旭暉, 樂軍, 張忠順, 等. γ-干擾素釋放試驗 (IGRA) 的診斷價值探討 (高感染率背景下的研究結(jié)果). 中國防癆雜志, 2010,32 (12): 801-805.

[4] Dye C. Global epidemiology of tuberculosis. Lancet, 2006, 367(9514): 938-940.

[5] Mazurek GH, Jereb J, Lobue P, et al. Guidelines for using the QuantiFERON-TB Gold test for detectingMycobacteriumtuberculosisinfection, United States. MMWR Recomm Rep, 2005, 54(RR-15): 49-55.

[6] Mazurek GH, Jereb J, Vernon A, et al. Updated guidelines for using Interferon Gamma Release Assays to detectMycobacteriumtuberculosisinfection-United States, 2010. MMWR Recomm Rep, 2010, 59(RR-5)：1-25.

[7] Diel R, Goletti D, Ferrara G, et al. Interferon-γ release assays for the diagnosis of latentMycobacteriumtuberculosisinfection: a systematic review and meta-analysis. Eur Respir J, 2011, 37(1): 88-99.

[8] 劉斌, 殷水澤, 馬世武, 等. 全血 γ 干擾素釋放試驗在擬診結(jié)核患者中的應用價值. 西南國防醫(yī)藥, 2014, 24(7): 721-723.

[9] Diel R, Loddenkemper R, Nienhaus A. Evidence-based comparison of commercial interferon-gamma release assays for detecting active TB: a metaanalysis. Chest, 2010, 137(4): 952-968.

[10] 李剛. 轉(zhuǎn)錄因子 T-bet, Eomes 和 IL-33 對 CD8+記憶和效應 T 細胞抗腫瘤的作用機制. 蘇州：蘇州大學, 2013.

[11] 李嫣紅, 謝燦茂. Th1/Th2 免疫應答系統(tǒng)在結(jié)核性胸膜炎患者中的表達. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2004, 27(5): 324-327.

[12] Tong ZH, Shi HZ. Subpopulations of helper T lymphocytes in tuberculous pleurisy. Tuberculosis(Edinb), 2013, 93(3): 279-284.

[13] 林艷榮, 許丁空. 肺結(jié)核患者 T 淋巴細胞亞群的檢測及臨床意義.內(nèi)科, 2007, 2(3): 320-321.

(本文編輯：薛愛華)

Comparative of the test results of tuberculosis and malignant tumor by interferon-gamma release assays

HUANG Yi, DANG Li-yun, GUO Qi, ZHANG Yao-hui, XIE Kun, WANG Long-zhi.

Xi’an Tuberculosis and Thoracic Tumor Hospital, Xi’an 710061, China

DANG Li-yun, Email: dangliyun@sina.com

Objective To compare the test results of tuberculosis (TB) patients, malignant tumor patients and healthy people by interferon-gamma release assays (IGRAs), and analyze the clinical significance. Methods A total of 164 patients who were treated and 50 people had health checkup in the Xi’an Tuberculosis and Thoracic Tumor Hospital from March 2014 to December 2014 was involved in this study. The patients were divided into TB group (51 cases), malignant tumor group (72 cases) and pneumonia group (41 cases), 50 people was in health group. We adopted the kits which were produced by HaiKou WeiTiYuan biological research institute. All data were analyzed with SPSS 13.0 software. Chi-square test was applied for categorical data.P<0.05 was statistically significant. Results The positive rates by IGRAs were 98.0% (50/51) for TB group, 50.0% (36/72) for malignant tumor group, 29.3% (12/41) for pneumonia group and 8.0% (4/50) for health group. Compared with health group, the positive rates of TB group, malignant tumor group and pneumonia group were significantly higher (χ2=82.26, 23.62, 7.03,P<0.05). However, the positive rates of various types of malignant tumor were similar (χ2=2.27,P>0.05), including 54.8% (17/31) for lung adenocarcinoma, 38.9% (7/18) for lung squamous carcinoma, 40.0% (4/10) in small cell lung cancer and 61.5% (8/13) for others. Conclusion The IGRAs has higher sensitivity and lower specificity in the diagnosis of TB. And it has high positive rate in the malignant tumor, which needs further research.

Tuberculosis/diagnosis; Carcinoma; Interferon-gamma release tests; Enzyme-linked immunosorbent assay

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.012

710061 西安市結(jié)核病胸部腫瘤醫(yī)院

黨麗云，Email：dangliyun@sina.com

2015-02-09)