盧春鳳，王淑秋，陳廷玉，張明遠，王淑湘，王建杰，袁慶

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

槲皮素抑制異煙肼誘導的L-02細胞線粒體氧化應激性DNA損傷*

盧春鳳，王淑秋△，陳廷玉，張明遠，王淑湘，王建杰，袁慶

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的:探討活性氧(ROS)介導的線粒體氧化損傷在異煙肼(INH)誘導L－02細胞DNA損傷中的作用及槲皮素對細胞的保護作用。方法:建立體外培養(yǎng)INH致肝細胞L－02損傷的模型，將細胞分為對照(control)組、INH組、槲皮素低劑量(Que low)及高劑量(Que high)組。利用彗星試驗評價細胞DNA損傷;制備L－02細胞線粒體，應用熒光探針DCFH－DA和rhodamine 123檢測細胞線粒體ROS水平及線粒體膜電位(ΔΨm);采用TBA法測定丙二醛(MDA)含量;應用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)的活性;采用Western blotting法檢測細胞中Bcl－2和Bax蛋白表達，計算Bax/Bcl－2值。結果:INH可誘導L－02細胞DNA損傷，使細胞線粒體ROS水平、細胞MDA含量及Bax/Bcl－2值明顯增高，并使細胞ΔΨm值和SOD活性明顯下降。而槲皮素能減輕細胞DNA損傷，減少細胞ROS水平，增加細胞ΔΨm值，降低細胞MDA含量，增加SOD活性，減少Bax/Bcl－2值。結論:INH可通過誘導細胞線粒體氧化應激導致L－02細胞DNA損傷。槲皮素能減輕INH誘導L－02細胞的DNA損傷，對L－02細胞具有保護作用，可能與其抑制ROS介導的線粒體氧化損傷有關。

槲皮素;異煙肼;線粒體氧化損傷;L－02細胞;DNA損傷

氧化應激是許多藥物引起肝臟毒性的主要機制，線粒體是細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的主要場所，也是氧化損傷的主要靶點［1］。異煙肼(isonicotinyl hydrazide，INH)有很多不良反應，最嚴重的是肝臟損傷，但到目前為止其肝臟毒性的具體機制尚未闡明［2］。槲皮素(quercetin，Que)屬類黃酮物質(zhì)，廣泛存在于水果、蔬菜和一些中草藥中，是具有臨床應用前景的抗氧化劑。因此，本實驗以體外培養(yǎng)的人肝細胞L－02為研究對象，利用差速離心法制備細胞線粒體，在亞細胞水平上研究ROS介導的線粒體氧化損傷在INH誘導L－02細胞DNA損傷中的作用，進一步探討INH的肝細胞毒性機制及槲皮素的保護效應和機制，以期為臨床防治INH的肝臟毒性提供一定的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 細胞和主要試劑

正常人肝細胞L－02購自中國科學院上海細胞庫;胎牛血清為HyClone產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品;槲皮素、異煙肼(INH)、DCFH－DA和rhodamine 123均為Sigma產(chǎn)品;正常熔點瓊脂糖和低熔點瓊脂糖均為Amresco產(chǎn)品;丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺均為Merck產(chǎn)品;兔抗Bcl－2和Bax多克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及處理用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)L－02細胞，鏡下觀察細胞生長情況，取生長狀態(tài)良好的細胞進行試驗。將細胞分為4組:對照組(加入與處理組相同體積的無血清培養(yǎng)基);INH(10 mmol/L)組;槲皮素低劑量(25 μmol/L)組;槲皮素高劑量(50 μmol/L)組。

2.2 指標檢測按上述分組將L－02細胞處理24 h后，收集細胞，利用彗星試驗評價細胞DNA損傷情況，用CASP彗星分析軟件進行圖像分析，分析指標包括DNA的尾長(tail length)、尾部DNA(tail DNA)百分含量和尾矩(tail moment)。差速離心法制備L－02細胞線粒體，應用熒光探針DCFH－DA和rhodamine 123檢測細胞線粒體ROS水平及線粒體膜電位(ΔΨm);采用TBA法測定細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量;應用黃嘌呤氧化酶法評估細胞內(nèi)抗氧化酶SOD的活性;采用Western blotting法檢測細胞中凋亡調(diào)控蛋白Bcl－2和Bax表達，并計算Bax/Bcl－2值。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。應用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，并用Origin 7.5作圖。組間均數(shù)比較采用單因素方差進行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 槲皮素和INH對細胞DNA損傷的影響

槲皮素和INH處理L－02細胞24 h后，進行單細胞凝膠電泳，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞DNA損傷情況:正常組細胞的DNA大部分呈圓形熒光團，無拖尾現(xiàn)象;INH組的細胞DNA有拖尾現(xiàn)象，呈現(xiàn)不同程度的頭尾分明的典型彗星圖像;槲皮素組的細胞DNA拖尾現(xiàn)象明顯減輕，高劑量組的效果更明顯。應用CASP彗星分析軟件進行圖像分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，INH組細胞DNA的尾長、尾部DNA百分含量和尾矩均顯著增加(P＜0.01)，表明INH誘導了細胞DNA損傷;槲皮素組細胞DNA的尾長、尾部DNA百分含量和尾矩均明顯減少，與INH組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明槲皮素減輕了INH對細胞DNA的損傷，對L－02細胞有保護作用，且高劑量組的保護作用更顯著，見圖1～3。

Figure 1.The effects of quercetin and INH on tail length of DNA in L－02 cells.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.圖1 槲皮素和INH對L-02細胞DNA尾長的影響

Figure 2.The effects of quercetin and INH on tail DNA of DNA in L－02 cells.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.圖2 槲皮素和INH對L-02細胞尾部DNA百分含量的影響

Figure 3.The effects of quercetin and INH on tail moment of DNA in L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.圖3 槲皮素和INH對L-02細胞DNA尾矩的影響

2 槲皮素和INH對細胞線粒體ROS生成的影響

由圖4可見，經(jīng)INH處理L－02細胞后，與對照組相比，細胞線粒體的ROS水平顯著增高(P＜0.01)，表明INH可誘導細胞線粒體ROS的生成;槲皮素組的細胞線粒體ROS水平均明顯降低，與INH組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明槲皮素可抑制細胞線粒體ROS的生成，且高劑量組抑制細胞線粒體ROS生成的作用更顯著。

Figure 4.The effects of quercetin and INH on the mitochondrial ROS generation in L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.圖4 槲皮素和INH對L-02細胞線粒體ROS生成的影響

3 槲皮素和INH對線粒體膜電位的影響

由圖5可見，經(jīng)INH處理L－02細胞后，與對照組相比，細胞ΔΨm值顯著下降(P＜0.01)，表明INH可造成細胞線粒體損傷;槲皮素組的細胞ΔΨm值均明顯增高，與INH組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明槲皮素對細胞線粒體有保護作用，且高劑量組對細胞線粒體的保護作用更明顯。

Figure 5.The effects of quercetin and INH on ΔΨmin L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.圖5 槲皮素和INH對L-02細胞線粒體膜電位的影響

4 槲皮素和INH對細胞丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的影響

由圖6可見，經(jīng)INH處理L－02細胞后，與對照組相比，細胞的MDA含量明顯增加(P＜0.01)，表明INH可使細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應;槲皮素組細胞的MDA含量均明顯減少，與INH組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明槲皮素有抗脂質(zhì)過氧化作用，且高劑量組的作用更顯著。

Figure 6.The effects of quercetin and INH on the content of MDA in L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.圖6 槲皮素和INH對L-02細胞MDA含量的影響

5 槲皮素和INH對細胞SOD活性的影響

由圖7可見，經(jīng)INH處理L－02細胞后，與對照組相比，細胞的SOD活性顯著降低(P＜0.01)，表明INH可降低細胞的抗氧化能力;槲皮素組細胞的SOD活性均明顯增高，與INH組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明槲皮素增加細胞的抗氧化能力，且高劑量組的作用更顯著。

Figure 7.The effects of quercetin and INH on the activity of SOD in L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs INH group.圖7 槲皮素和INH對L-02細胞SOD活性的影響

6 槲皮素和INH對細胞凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax表達的影響

經(jīng)INH處理L－02細胞后，與對照組相比，細胞的Bcl－2蛋白表達明顯減少，而Bax蛋白表達明顯增加，Bax/Bcl－2值顯著增高(P＜0.01);槲皮素高劑量組細胞Bcl－2蛋白表達明顯增多，而Bax蛋白表達明顯減少，Bax/Bcl－2值明顯降低，與INH組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖8。

Figure 8.The effects of quercetin and INH on the ratio of Bax/ Bcl－2 in L－02 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs INH group.圖8 槲皮素和INH對L-02細胞Bax/Bcl-2值的影響

討論

正常情況下，細胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當細胞內(nèi)ROS等自由基生成增加和/或抗氧化系統(tǒng)的清除能力降低，細胞將會發(fā)生氧化應激反應，引起細胞內(nèi)大分子物質(zhì)發(fā)生氧化損傷，從而造成細胞損傷［3］。線粒體是細胞產(chǎn)生ROS的主要場所，也是多數(shù)有毒化合物攻擊的主要靶點。研究表明，ROS過多生成可損傷線粒體膜，導致ΔΨm值下降［4－5］。

為了觀察INH是否能誘導L－02細胞DNA損傷，進而研究槲皮素的作用及機制，我們利用彗星試驗評價了細胞DNA損傷情況，評價指標包括細胞DNA的尾長、尾部DNA百分含量和尾矩，其中，尾長是指DNA從細胞中心遷移的距離，在低損傷劑量范圍內(nèi)與DNA損傷呈線性關系;尾部DNA百分含量反映細胞拖尾中DNA碎片的多少，尾部DNA百分含量與損傷程度有關;尾矩是指從彗星頭部的右邊界到彗星尾部末端的距離與尾部DNA百分含量的乘積，也與損傷程度呈線性關系。實驗結果顯示，INH能誘導L－02細胞DNA損傷，而槲皮素對受損傷細胞有保護作用。那么INH誘導L－02細胞DNA損傷是否與ROS及線粒體損傷有關?因此，本實驗檢測了細胞線粒體ROS水平及ΔΨm值。ROS是細胞內(nèi)主要的氧自由基，它的水平能反映細胞內(nèi)氧化系統(tǒng)的情況;ΔΨm值是反映線粒體功能的關鍵指標，ΔΨm值降低提示細胞發(fā)生線粒體損傷［6］。L－02細胞經(jīng)INH處理后，細胞線粒體ROS生成顯著增多，ΔΨm值明顯下降;而槲皮素能明顯減少細胞線粒體ROS生成，并增加細胞ΔΨm值，提示INH能促進細胞線粒體ROS生成，導致細胞線粒體損傷;槲皮素能減輕INH誘導的細胞線粒體損傷。

INH能造成細胞線粒體損傷，那么INH誘導L－02細胞DNA損傷是否與ROS介導的氧化損傷有關?因此，本實驗進一步檢測了氧化損傷的重要指標MDA和SOD。MDA是典型的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量的多少可反映細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細胞發(fā)生氧化損傷的程度;SOD能清除自由基，是細胞內(nèi)重要的抗氧化物酶，其活性的高低可反映細胞的抗氧化能力［7］。研究表明，槲皮素在體外可通過與金屬離子結合、清除ROS等自由基及抑制DNA損傷等發(fā)揮抗氧化作用［8－10］。此外，體內(nèi)實驗已證實槲皮素可通過降低脂質(zhì)過氧化物水平、增加抗氧化系統(tǒng)的能力對氧化損傷的肝臟發(fā)揮保護效應［11］。實驗結果發(fā)現(xiàn)，L－02細胞經(jīng)INH處理后，細胞中MDA含量顯著增高，而SOD的活性顯著降低，表明在本實驗條件下INH可誘導L－02細胞發(fā)生氧化損傷。這提示INH進入細胞內(nèi)，可能誘導細胞線粒體大量生成ROS，降低細胞SOD活性，使細胞內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導致線粒體損傷，進而誘發(fā)氧化應激反應，使線粒體受損，引起ΔΨm值下降，氧化產(chǎn)物MDA含量增加，DNA鏈斷裂，造成細胞損傷及細胞凋亡［12］。實驗還發(fā)現(xiàn)，槲皮素能減少細胞MDA含量，增加SOD的活性，表明槲皮素能減輕INH誘導的L－02細胞氧化損傷，可能是通過清除細胞線粒體ROS，提高細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的能力，抑制線粒體氧化應激反應，從而發(fā)揮其作用。

此外，本實驗還檢測了Bcl－2和Bax蛋白表達，并計算Bax/Bcl－2值。Bcl－2和Bax是調(diào)控細胞凋亡重要蛋白，Bax是促凋亡蛋白，而Bcl－2是抑凋亡蛋白［13］，一般認為Bax和Bcl－2的比值是決定細胞是否發(fā)生凋亡的關鍵因素。研究表明，細胞ΔΨm值下降可促進Bax由細胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體膜，進而啟動線粒體凋亡途徑，激活caspase蛋白酶家族，使DNA降解，造成DNA損傷［14－15］。實驗結果發(fā)現(xiàn)，INH能下調(diào)細胞Bcl－2蛋白表達，上調(diào)Bax蛋白表達，增加Bax/Bcl－2值，表明INH可誘導細胞凋亡;高劑量槲皮素能上調(diào)細胞Bcl－2蛋白表達，下調(diào)Bax蛋白表達，使Bax/Bcl－2值降低，表明槲皮素可通過調(diào)整Bax和Bcl－2的比例發(fā)揮其抗凋亡的作用，進而保護細胞免受損傷。

綜上所述，在本實驗條件下，INH能誘導L－02細胞DNA損傷，ROS介導的細胞線粒體氧化損傷在此過程中發(fā)揮了重要作用。槲皮素能減輕INH誘導L－02細胞的DNA損傷效應，對L－02細胞具有保護作用，可能與其抑制ROS介導的線粒體氧化損傷有關。

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Protective effect of quercetin on L-02 cells by inhibiting DNA damage of INH-induced mitochondrial oxidative stress

LU Chun－feng，WANG Shu－qiu，CHEN Ting－yu，ZHANG Ming－yuan，WANG Shu－xiang，WANG Jian－jie，YUAN Qing

(Basic Medical College，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China.E-mail:wang_shuq@163.com)

AIM:To investigate the role of reactive oxygen species(ROS)－mediated mitochondrial oxidative injury in isonicotinyl hydrazide(INH)－induced DNA damage and the protective effect of quercetin on L－02 cells.METHODS:The injury model of hepatocyte L－02cells in vitro induced by INH was established.The cells were divided into control group，INH group，low－dose quercetin group and high－dose quercetin group.The DNA damage of L－02 cells was evaluated by the comet test.The mitochondrion was prepared，and the level of mitochondrial ROS and the value of mitochondrial membrane potential(ΔΨm)were detected by fluorescent probes DCFH－DA and rhodamine 123.The content of MDA was measured by TBA method.The activity of SOD was assessed with the xanthine oxidase method.The protein expression of Bcl－2 and Bax was determined by Western blotting，and the value of Bax/Bcl－2 was calculated.RESULTS:INH induced obvious DNA damage，increased the level of mitochondrial ROS，the content of MDA and the value of Bax/ Bcl－2，and markedly reduced the value of ΔΨmand the activity of SOD in the L－02 cells.Quercetin attenuated DNA damage，reduced the level of mitochondrial ROS，elevated the value of ΔΨm，declined the content of MDA，increased the activity of SOD and decreased the value of Bax/Bcl－2 in the L－02 cells.CONCLUSION:INH induces DNA damage in L－02 cells by generation of mitochondrial oxidative stress.Quercetin has a protective effect on L－02 cells to attenuate the INH－induced DNA damage by inhibiting ROS－mediated mitochondrial oxidative damage.

Quercetin;Isoniazid;Mitochondrial oxidative damage;L－02 cells;DNA damage

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.021

1000－4718(2015)02－308－05

2014－09－03

2014－10－23

國家自然科學基金資助項目(No.81373497);黑龍江省自然科學基金資助項目(No.D201248);佳木斯大學科學技術研究項目(No.Sjz2012－09)

△通訊作者Tel:0454－8618518;E－mail:wang_shuq@163.com