李強，郭壯波，伍光穎，李超霞，鐘志勇

(暨南大學醫(yī)學院第四附屬醫(yī)院，廣州市紅十字會醫(yī)院1急診科，2檢驗科，廣東 廣州 510220;3廣東省醫(yī)學動物實驗中心，廣東 佛山 528248)

阿托伐他汀對急性心肌梗死大鼠內皮微顆粒及心肌細胞凋亡的影響*

李強1△，郭壯波1，伍光穎1，李超霞2，鐘志勇3

(暨南大學醫(yī)學院第四附屬醫(yī)院，廣州市紅十字會醫(yī)院1急診科，2檢驗科，廣東 廣州 510220;3廣東省醫(yī)學動物實驗中心，廣東 佛山 528248)

目的:探討阿托伐他汀(atorvastatin，AT)對大鼠急性心肌梗死早期內皮微顆粒(endothial microparticles，EMP)及心肌細胞凋亡的影響。方法:將24只雄性SD大鼠隨機分為假手術組(sham組)、心肌梗死組(MI組)和阿托伐他汀心肌梗死組(MI+AT組)，每組8只。采用冠狀動脈結扎制作急性心肌梗死大鼠模型。分別在造模后2 h和24 h采外周血檢測肌酸激酶同工酶(creatine kinase－MB，CK－MB)、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和EMP，其中循環(huán)EMP用流式細胞術檢測。通過TUNEL檢測心肌細胞凋亡情況。結果:造模后2 h，MI組大鼠的CK－MB表達水平較sham組大鼠顯著升高(P＜0.05);MI組及MI+AT組大鼠EMP表達水平及心肌細胞凋亡率上升，顯著高于sham組(P＜0.05)。造模后24 h，MI組大鼠EMP表達水平顯著高于sham組(P＜0.05);MI+ AT組大鼠CK－MB、cTnT、EMP表達水平及心肌細胞凋亡率較MI組顯著降低(P＜0.05)。此外，MI組大鼠的CKMB表達水平在造模后24 h較造模后2 h顯著升高(P＜0.05);MI+AT大鼠CK－MB、cTnT和EMP表達水平在造模后24 h較2 h顯著下降(P＜0.05)。結論:AT可降低大鼠急性心肌梗死時的EMP水平和心肌細胞凋亡率，提示AT對內皮功能有保護作用。

急性心肌梗死;阿托伐他汀;內皮微顆粒;心肌細胞凋亡

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病極為嚴重的臨床類型之一，是多種因素導致冠狀動脈內斑塊糜爛及破裂、血栓形成、血管痙攣，使冠狀動脈血供急劇減少甚至中斷，心肌發(fā)生嚴重而持久的缺血導致的心肌壞死。目前認為血管內皮功能障礙正是動脈粥樣硬化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)和始動因素。內皮微顆粒(endothelial microparticles，EMP)是內皮細胞激活或凋亡時產生的膜性小囊泡，其水平的升高在包括冠狀動脈疾病在內的多種病理狀態(tài)中可見，并反映內皮功能受損及臨床預后不良。他汀類作為抗動脈粥樣硬化藥物能明顯降低冠心病患者心血管事件的發(fā)生率，已廣泛應用于冠心病患者的二級預防，但其改善冠心病患者預后的機制尚未完全闡明。本研究擬建立大鼠急性心肌梗死模型，通過檢測心肌梗死不同時段EMP、肌酸激酶同工酶(creatine kinase－MB，CK－MB)和心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)的動態(tài)變化，并統計大鼠心肌缺血后心肌細胞凋亡率，揭示阿托伐他汀(atorvastatin，AT)對大鼠急性心肌梗死時內皮的保護作用。

材料和方法

1 實驗動物、試劑和儀器

健康雄性SPF級SD大鼠24只，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供(實驗動物使用許可證號為SYXK粵2013－0002)。根據體重隨機分為sham組、MI組、MI+AT組，每組8只。

阿托伐他汀鈣片(輝瑞愛爾蘭藥品公司);CKMB試劑盒(武漢華美生物科技);cTnT ELISA Kit (武漢華美生物科技);CD31－PE熒光標記單抗、CD42b－FITC熒光標記單抗(BD)。

7020 型全自動生化分析儀(HITACHI)，流式細胞儀(BD)。

2 方法

2.1 實驗分組Sham組:大鼠進行開胸與穿線處理，但不結扎阻斷冠狀動脈左前降支;MI組:在sham組的基礎上，結扎冠狀動脈左前降支，結扎后不再復通;MI+AT組:在MI組的基礎上，給予阿托伐他汀溶液灌胃。

2.2 給藥方法造模前1 h進行灌胃給藥，根據大鼠體重，灌胃劑量均為10 mg/kg，劑量參考文獻選擇［1］;sham組、MI組大鼠給予等量的0.9%氯化鈉溶液;MI+AT組大鼠給予阿托伐他汀溶液。

2.3 心肌梗死模型構建大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉，剃去頸部和胸部毛發(fā)，以75%乙醇擦拭消毒頸部皮膚后作正中切口約1 cm，暴露氣管，進行氣管插管并連接呼吸機(呼吸機工作條件為呼吸頻率70～80次/min，潮氣量7～8 mL，呼吸時間比為1∶1)。待大鼠呼吸與呼吸機同步后，測量大鼠心電圖基礎值。取心電圖無異常大鼠，消毒胸部皮膚后，剪開皮膚并鈍性分離胸部肌肉直至暴露肋骨，剪開第3、4根肋骨，擴開大鼠胸腔，充分暴露心臟。用眼科鑷撕開大鼠心臟心包膜，尋找大鼠左心耳與動脈圓錐，在左心耳與動脈圓錐之間穿入0號線，結扎，以心電圖Ⅱ導聯檢測，有典型缺血心電圖改變者判定冠狀動脈左前降支成功結扎，可進行下一步縫合或者復通操作。大鼠模型建立完畢后，逐層縫合大鼠肌肉和皮膚，擠出大鼠胸腔空氣后撤去呼吸機，歸籠單籠飼養(yǎng)。

2.4 標本的采集與處理Sham組以穿線為造模結束時點，MI組、MI+AT組，以復通冠狀動脈左前降支為造模結束時點，在造模結束后2 h及24 h，采集大鼠血清與血漿(檸檬酸鈉抗凝)，于－80℃保存?zhèn)溆茫S后解剖取大鼠心臟，以4%中性甲醛固定。

2.5 指標測定依照ELISA Kit說明書檢測血清cTnT含量;用全自動生化分析儀檢測血清CK－MB含量;用流式細胞術［2］檢測血漿EMP含量，樣本加抗CD31－PE(按1∶100比例用PBS稀釋)和抗CD42b－FITC(按1∶200比例用PBS稀釋)各10 μL，然后加入50 μL血漿樣本，避光孵育30 min，孵育結束后加入1 000 μL PBS混勻待測，設定上機吸樣速度為中速，吸樣時間為30 s，上機檢測EMP，記錄CD31+/ CD42b－為EMP的量。

2.6 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡大鼠造模后2 h及24 h分別處死，取心臟固定后制備石蠟切片，依照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Roche)進行操作，DAB染色，光學顯微鏡下每張切片選取具有代表性的3個視野，使用IPP 6.0軟件分別對凋亡細胞(細胞核呈棕色)和正常細胞進行計數，統計不同大鼠心肌細胞的凋亡率。

3 統計學處理

各組數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 21.0統計軟件進行單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 各組CK-MB的活性比較

造模后2 h，MI組大鼠的CK－MB水平較sham組大鼠顯著升高(P＜0.05);造模后24 h，MI+AT組CK－MB水平較MI組顯著下降(P＜0.05);各組間比較，sham組大鼠的CK－MB水平在造模后2 h與造模后24 h比較無顯著差異(P＞0.05);MI組大鼠的CK－MB水平在造模后24 h較2 h顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05);MI+AT大鼠的CK－MB水平在造模后24 h較2 h顯著下降(P＜0.05)，見表1。

2 ELISA檢測各組大鼠cTnT的水平

造模后2 h，MI組大鼠血清中cTnT的水平和Sham組相近，無顯著差異(P＞0.05);MI+AT組大鼠的cTnT水平高于MI組，但無顯著差異(P＞0.05)。造模后24 h，MI組大鼠血清中cTnT的水平高于sham組，但差異無統計學意義(P＞0.05);MI +AT組大鼠的cTnT水平低于MI組，差異有統計學意義(P＜0.05)。各組間cTnT的水平造模后2 h與造模后24 h的比較，sham組、MI組大鼠的cTnT水平在造模后2 h和造模后24 h比較均無明顯變化(P＞0.05)，MI+AT組大鼠的cTnT水平在造模后24 h較造模后2 h降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠CK-MB和cTnT的表達Table 1.The expression of CK－MB and cTnT in different groups(Mean±SD.n=8)

3 流式細胞術檢測各組大鼠EMP水平

造模后2 h，MI組及MI+AT組大鼠的EMP水平上升，顯著高于sham組(P＜0.05)。造模24 h后，MI組大鼠的EMP水平顯著高于sham組(P＜ 0.05)。各組間比較，造模后24 h，MI+AT組大鼠的EMP水平較MI組顯著降低，有統計學差異(P＜0.05);MI+AT組大鼠的EMP水平造模后24 h較造模后2 h明顯降低(P＜0.05)，見圖1、2及表2。

Figure 1.Scatter plot of flow cytometry analysis for EMP at 2 h after modeling in sham group，MI group and MI+AT group.圖1 造模后2 h sham組、MI組和MI+AT組EMP的流式細胞圖

4 TUNEL檢測各組SD大鼠心肌細胞凋亡率

造模后2 h MI組及MI+AT組大鼠的心肌細胞凋亡率分別較sham組顯著提高，差異有統計學意義(P＜0.05)。造模后24 h，MI+AT組大鼠的心肌細胞凋亡率比MI組顯著降低(P＜0.05)。各組間比較，MI+AT組大鼠的心肌細胞凋亡率造模后24 h較造模后2 h明顯降低(P＜0.05)，見圖3、4及表2。

Figure 2.Scatter plot of flow cytometry analysis for EMP at 24 h after modeling in sham group，MI group and MI+AT group.圖2 造模后24 h sham組、MI組和MI+AT組的EMP流式細胞術散點圖

Figure 3.TUNEL staining at 2 h after modeling in sham group，MI group and MI+AT group(×400).圖3 造模后2 h sham組、MI組和MI+AT組大鼠心肌的TUNEL染色結果

Figure 4.TUNEL staining at 24 h after modeling in sham group，MI group and MI+AT group(×400).圖4 造模后24 h sham組、MI組和MI+AT組大鼠心肌的TUNEL染色結果

表2 各組大鼠血清中EMP水平和心肌細胞凋亡率的比較Table 2.The expression of EMP and myocardial apoptotic rate in different groups(Mean±SD.n=8)

討論

EMP是內皮細胞激活或凋亡時釋放的一種膜性囊泡。目前普遍認為EMP不僅是存在于循環(huán)中的內皮細胞脫落的碎片，而且通過其表面不同蛋白分子與靶細胞相互作用起到信息傳遞的作用，并參與到許多與循環(huán)系統疾病相關的病理生理過程中。近年來研究發(fā)現，EMP在急性冠脈綜合征患者中顯著升高，而內皮功能受損恰恰與EMP升高相關［3－7］，表明EMP能直接反映內皮細胞在受到不良因素刺激時生物表型的變化，是敏感、可靠的內皮功能障礙的生化指標［8］。因此穩(wěn)定細胞膜降低EMP的釋放被認為是血管疾病治療的有效靶點［9］。他汀類藥物是指南強烈推薦的調脂藥，不僅具有調脂作用，還具有抑制炎癥反應和氧化應激、改善血管內皮功能、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊等多種獨立于調脂作用外的“多效性”［10－11］。阿托伐他汀屬于他汀類調脂藥，是具有較強的羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制作用的新一代他汀類藥物。近年研究發(fā)現，阿托伐他汀除具有調脂作用外還通過影響細胞信號轉導及細胞增殖，發(fā)揮改善內皮功能失調、抑制炎癥反應、抗血栓形成、穩(wěn)定斑塊等心血管保護作用［12］。阿托伐他汀還被證實可以通過增強和改善冠狀動脈及外周動脈內皮細胞的功能，從而減少梗死面積［13］，使缺血心肌組織得到有效再灌注。有關阿托伐他汀的ARMYDARECAPTURE研究［14］證實了他汀類藥物為冠心病患者帶來的益處。本研究顯示造模后2 h，MI組及MI +AT組大鼠的EMP水平上升，顯著高于sham組，而造模后24 h，MI+AT組大鼠的EMP水平及心肌細胞凋亡率較MI組則顯著降低，減輕EMP介導的內皮損傷過程，提示阿托伐他汀有助于改善內皮功能。

凋亡是一種多基因控制的自身程序性細胞死亡。早期的研究表明，它是心肌梗死早期細胞死亡的主要方式及梗死面積擴大的原因之一，并認為其心肌梗死面積的大小與心肌梗死后心肌細胞凋亡程度有關。Sun等［15］發(fā)現缺血后再灌注時間延長能降低心肌梗死面積，這種心臟保護作用可能是通過抗凋亡機制實現的。故如能早期干預，抑制心肌細胞凋亡，有利于改善MI后的心室功能。既往已有研究報道阿托伐他汀可以顯著改善心肌梗死后心肌細胞凋亡、心肌重塑及心臟功能，發(fā)揮它降脂外的多重作用［16－19］。阿托伐他汀通過抑制MI心肌細胞凋亡，提高左心室射血分數，降低左心室舒張末內徑，改善心臟功能。B?cklund等［16］還發(fā)現梗死相關動脈閉塞組患者的心肌細胞凋亡率顯著高于梗死相關動脈開通組，梗死相關動脈通暢后顯著降低急性MI后晚期的心肌細胞凋亡率，顯著改善了MI患者的長期預后。Sun等［15］發(fā)現缺血后再灌注時間延長能降低心肌梗死面積，這種心臟保護作用可能是通過抗凋亡機制實現的。本研究顯示MI+AT組大鼠的CK－MB、cT－nT表達水平及心肌細胞凋亡率均顯著低于MI組，也證實了AT的心血管保護作用。

本研究因條件所限，僅通過檢測血漿EMP及心肌細胞凋亡率的變化闡述阿托伐他汀對內皮的保護作用。近來有研究表明，血管內皮細胞的前體內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在血管受損的條件下可被誘導歸巢至受損血管區(qū)域，進而參與血管新生修復［20］。EPCs數量已被作為心血管疾病診斷及預后評價的重要指標［21］。而阿托伐他汀有增加循環(huán)系統EPCs數量、促進損傷內皮修復、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊等功能，如能聯合檢測血漿EMP及EPCs數量或可進一步證實阿托伐他汀的內皮保護作用，有望成為今后的研究熱點。

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Effects of atorvastatin on release of endothelial microparticles and myocardial apoptosis in rats with acute myocardial infarction

LI Qiang1，GUO Zhuang－bo1，WU Guang－ying1，LI Chao－xia2，ZHONG Zhi－yong3

(1Department of Emergency，2Clinical Laboratory，Guangzhou Red Cross Hospital，the Fourth Affiliated Hospital，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510220，China;3Medical Laboratory Animal Center of Guangdong Province，Foshan 528248，China.E-mail:wliqiang@163.com)

AIM:To investigate the effect of atorvastatin(AT)on the release of endothelial microparticles (EMP)and myocardial apoptosis in the rats with myocardial infarction.METHODS:SD male rats(n=24)were randomly divided into 3 groups:sham operation(sham)group，myocardial infarction(MI)group and MI+AT group.The rat model of acute myocardial infarction was prepared by coronary artery ligation.At 2 h and 24 h after modeling，the peripheral blood was collected to detect creatine kinase－MB(CK－MB)and cardiac troponin T(cTnT).The circulating levels of EMP were measured by flow cytometry.The myocardial apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling(TUNEL)assay.RESULTS:At 2 h after modeling，the level of CK－MB was significantly increased in MI group compared with sham group，and the level of EMP and the myocardial apoptotic rate were significantly increased in MI group and MI+AT group compared with sham group.At 24 h after modeling，the level of EMP was significantly increased in MI group compared with sham group.The levels of CK－MB，cTnT，EMP and the myocardial apoptotic rate were significantly decreased in MI+AT group compared with MI group.Moreover，the level of CK－MB in MI group was significantly increased at 24 h compared with that at 2 h after modeling.The levels of CK－MB，cTnT and EMP were significantly decreased in MI+AT group at 24 h compared with those at 2 h after modeling.CONCLUSION:Ator－vastatin may reduce the level of EMP and the myocardial apoptotic rate in the rats with acute myocardial infarction，indicating that atorvastatin plays a role in protecting endothelium.

Acute myocardial infarction;Atorvastatin;Endothelial microparticles;Cardiomyocyte apoptosis

R542.2+1;R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.030

1000－4718(2015)02－359－06

2014－12－03

2014－12－16

廣東省科技計劃(No.2012B061700016)

△通訊作者Tel:020－34403518;E－mail:wliqiang@163.com