鄧麗，陳誠，胡丹，曾廣正，馬景勝，饒本強(qiáng)

(南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院胃腸病學(xué)研究所，江西 南昌 330006)

以TF為靶點(diǎn)的裸DNA疫苗脾內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌的免疫抑制作用*

鄧麗，陳誠，胡丹，曾廣正，馬景勝，饒本強(qiáng)△

(南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院胃腸病學(xué)研究所，江西 南昌 330006)

目的:探討以組織因子(tissue factor，TF)為靶點(diǎn)的裸DNA疫苗pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)單次注射對(duì)結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)的免疫抑制作用。方法:采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建攜帶TF靶向肽SPTT和免疫球蛋白H鏈基因的裸DNA質(zhì)粒pγ1.Ig H.SPTT，質(zhì)粒脾內(nèi)單次注射后，檢測(cè)外周血轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物SPTT－Ig H濃度，分析質(zhì)粒脾內(nèi)轉(zhuǎn)染效率、特性及其對(duì)CRC的作用。結(jié)果:重組pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)單次注射后第4周脾組織即有SPTT－Ig H融合基因強(qiáng)表達(dá)，12周強(qiáng)度開始下降，至16周消失;轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后第2周外周血SPTT－Ig H濃度為7.2 μg/L，后逐漸升高，第8周達(dá)高峰為13.11 μg/L;質(zhì)粒脾內(nèi)注射后轉(zhuǎn)錄基因定向在脾組織表達(dá)，淋巴結(jié)、骨髓、肝、腎、等組織未發(fā)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)染;pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌具有抑制作用(P＜0.01)。結(jié)論:以TF為靶點(diǎn)的裸DNA疫苗pγ1.Ig H.SPTT單次脾內(nèi)注射可以激發(fā)機(jī)體對(duì)結(jié)直腸癌的保護(hù)性免疫反應(yīng)，是治療CRC的一種安全有效的免疫方法。本課題研究為裸DNA疫苗抗腫瘤免疫治療提供了新的思路。

組織因子;裸DNA疫苗;結(jié)直腸癌

體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因免疫接種(somatic transgene immunization，STI)將含外源蛋白基因質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入體細(xì)胞，可誘發(fā)機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)［1］。STI激發(fā)的免疫反應(yīng)可以抑制病毒復(fù)制、殺滅細(xì)菌和寄生蟲，甚至抑制腫瘤生長，部分研究成果已批準(zhǔn)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)［2－3］。初步結(jié)果顯示裸DNA質(zhì)粒作為一種轉(zhuǎn)基因疫苗對(duì)腫瘤和感染性疾病的預(yù)防和治療具有潛在應(yīng)用前景。STI作用依賴于DNA在體細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分泌及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。然而，目前多數(shù)研究僅僅集中于外源DNA轉(zhuǎn)錄后最終所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)基因轉(zhuǎn)染的載體細(xì)胞、轉(zhuǎn)染產(chǎn)物的表達(dá)效率和提呈、轉(zhuǎn)染基因的歸宿等了解甚少，STI作為一種新型免疫治療方法尚未獲得滿意的療效［4－5］。

B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生于骨髓，并終生定位于次級(jí)淋巴器官和血液中。在受到抗原激活后，一個(gè)B淋巴細(xì)胞激活后每秒能產(chǎn)生1×103～8×104個(gè)免疫球蛋白分子，每個(gè)B淋巴細(xì)胞均是一個(gè)抗體生產(chǎn)微型工廠［6］;B淋巴細(xì)胞除分泌抗體外，還通過其膜表面Lg受體將其分泌的、含有它們自身Ig結(jié)構(gòu)的蛋白多肽提呈給T細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫［7］。因此，含有豐富B淋巴細(xì)胞的脾臟是裸DNA質(zhì)粒接種的理想器官［1］。

具有凝血和信號(hào)傳導(dǎo)功能的組織因子(tissue factor，TF)是腫瘤細(xì)胞干性標(biāo)志物［8］。最近，我們利用改良噬菌體展示技術(shù)篩選出了TF的小分子高親和短肽SPTT［9］，以此為靶向片段耦合免疫球蛋白效應(yīng)片段構(gòu)建了一種抗腫瘤免疫復(fù)合物——Benc［10－12］，Benc既能殺傷結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)細(xì)胞、抑制CRC新生血管形成，并毀損CRC成熟血管，對(duì)CRC有較好的抑制作用。本研究以SPTT為基本元件，采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建攜帶SPTT和免疫球蛋白效應(yīng)片段的裸DNA質(zhì)粒，觀察該質(zhì)粒STI脾內(nèi)單次轉(zhuǎn)染在脾B淋巴細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)情況及其產(chǎn)物對(duì)CRC所產(chǎn)生的保護(hù)性免疫反應(yīng)，探索一種新型、有效的抗腫瘤STI治療方法及其機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞系

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HT－29(ATCC，TF表達(dá)陽性)用含10%胎牛血清(HyClone)的RPMI－1640(Invitrogen)培養(yǎng)，置于含5%CO2的培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。CHO細(xì)胞(ATCC，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞)用EXCell/F12無血清培養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建和測(cè)序鑒定TF靶向小分子片段為本實(shí)驗(yàn)室采用改良噬菌體展示技術(shù)篩選、含7個(gè)堿基的小分子片段，已證實(shí)具有對(duì)TF高度靶向性和親和力，委托上海生工公司合成。真核表達(dá)質(zhì)粒γ1NANP含有人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus)高效啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，并攜帶鼠免疫球蛋白V區(qū)和人免疫球蛋白γ1C區(qū)嵌合基因的H鏈序列，由美國加利福尼亞大學(xué)癌癥中心Zanetti教授惠贈(zèng)。質(zhì)粒pSVNeo為γ1NANP的對(duì)照質(zhì)粒，與γ1NANP相比，pSVneo不含免疫球蛋白V區(qū)和γ1C區(qū)基因，購自Invitrogen。

質(zhì)粒pγ1.Ig H.SPTT由γ1NANP質(zhì)粒改造而成，即質(zhì)粒的H鏈V區(qū)CDR3環(huán)內(nèi)用2個(gè)重復(fù)SPTT片段CAT－GCT－TGT－GCT－GCG－CAG－TTT替換3個(gè)重復(fù)的AGU－GCG－AGU－CCG片段。插入酶切位點(diǎn)為HindⅢ和BamH I酶切位點(diǎn)。Taq DNA聚合酶、T4連接酶和主要限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa產(chǎn)品，見圖1。

pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒用DH5a按程序擴(kuò)增，采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN endo－free GIGA Kit)制備、純化，按下列公式計(jì)算DNA純度:DNA純度(%)=(11.1R－6.32)/(2.16－R)，R=A260/ A280。重組質(zhì)粒pγ1.Ig H.SPTT、γ1NANP和pSVneo委托Invitrogen公司測(cè)序鑒定。

Figure 1.A schematic diagram of pγ1.Ig H.SPTT plasmid used to express human immunoglobulin H chain(including the Fc fragment).A small nuclear gene fragment which targeted TF was implanted in CDR3ring as a tumor specific target fragment.Neor:neomycin resistance gene;Ampr:ampicillin resistance gene;IL－2: immune－enhancing gene;PR:promoter;EN:enhancer;CH:heavy chain constant region;VH:heavy chain variable region;FR:skeleton area.圖1 pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒示意圖

2.2pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)注射20只8～10周齡雌性C57BL/6小鼠先行腹腔注射戊巴比妥(75 mg/kg)麻醉后，于左腹位消毒皮膚、剔毛。自左肋下3～4 mm開一小切口，依次剖開腹部皮膚、肌肉和腹膜，暴露腸系膜，鉗夾腸系膜根部將整個(gè)脾臟牽拉出腹腔外。沿脾臟長軸方向用微量注射器緩慢注入100 μg質(zhì)粒DNA生理鹽水溶液(100 μg∶30 μL)，注射時(shí)盡量避免局部滲漏、出血，可見脾臟注射局部區(qū)域變白。注射完畢后將脾臟放回腹腔，仔細(xì)縫合腹膜、皮膚。手術(shù)完畢，小鼠置于37℃溫箱保暖促蘇醒，SPF條件下飼養(yǎng)。

2.3 pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)注射后轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的ELISA檢測(cè)pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)注射后不同時(shí)點(diǎn)(0、2、4、8、12、14周)，用間接ELISA法檢測(cè)外周血轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物SPTT－Ig H:包被抗原采用羊抗人γ球蛋白抗體(10 mg/L)，購自Sigma;II抗為HRP標(biāo)記的羊抗人γ球蛋白抗體，用TMB ELISA試劑顯色(Pierce)。

2.4 PCR和Southern雜交提取pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)注射后不同時(shí)點(diǎn)(0、4、12、16、24、36周)的脾組織DNA，取10 mg脾組織，蛋白酶消化，消化產(chǎn)物置入QIAamp離心柱(Qiagen)，10 000 r/min離心10 min，淘洗2次，雙蒸水稀釋DNA，1%瓊脂糖電泳定量分析。PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)4對(duì)引物(pCL/pCD、pSE/pNAD、pNEL/pNED、pbA1/pbA2):pCL(2 107～285 bp:5’－TTATTGAGAATAGAGGACATCTG－3’)和pCD(459～439 bp:5’－ATGCTCATAAAACTCCATAAC－3’)為擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄可變差異性插入?yún)^(qū)(variable diversity joining，VDJ)引物;pSE(232～211 bp: 5’－AACAGTATTCTTTCTTTGCAGC－3’)和pNAD (352～333 bp:5’－GAGAGTAGGGTACTGGGTTT－3’)為擴(kuò)增CDR3環(huán)中SPTT的引物;pNEL(169～189 bp:5’－AGCACCTACTATCCAGACACT－3’)和pNED (366～346 bp:5’－GTAGTCCATACCATGAGAGTA－3’)為巢式PCR內(nèi)引物;pbA1(184～201 bp:5’－TGGGCCGCCCTAGTCACC－3’)和pbA2(427～408 bp:5’－CGTTTGGCCTTAGGGTTCAG－3’)是按照序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增鼠β－actin基因的引物(圖2)。PCR反應(yīng)體系為0.3 mmol/L引物，0.2 mmol/L脫氧核苷酸，1.5 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，1 U Taq DNA多聚酶。PCR反應(yīng)條件:94°C 45 s，58°C 45 s，72°C 45 s，30個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR產(chǎn)物做Southern blotting分析，先行1%瓊脂糖凝膠電泳，Hybond尼龍膜(Amersham)轉(zhuǎn)膜6 h，pNAD寡聚核苷酸雜交，用攜帶［γ－32P］ATP的放射性探針T4核苷酸5’－羥基－激酶作為標(biāo)記進(jìn)行Southern雜交分析。

為確定基因轉(zhuǎn)錄的組織分布，按上述方法從脾臟、淋巴結(jié)、骨髓、肝、腎、肺和肌肉等組織中提取DNA，PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行對(duì)VDJ片段Southern雜交分析。

Figure 2.A schematic diagram of PCR primers to detect the gene product after transfection of pγ1.Ig H.SPTT into the spleen.圖2 質(zhì)粒pγ1.Ig H.SPTT脾內(nèi)轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物PCR檢測(cè)引物設(shè)計(jì)

2.5 STI技術(shù)脾內(nèi)單次注射pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒對(duì)CRC的免疫效應(yīng)(1)細(xì)胞培養(yǎng):人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HT－29，RPMI－1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，生長密度達(dá)90%左右時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。(2)DNA質(zhì)粒STI脾內(nèi)注射: 8周齡C57BL/6小鼠20只，按前述方法行脾內(nèi)免疫接種，pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)注射組10只，pSV－neo質(zhì)粒脾內(nèi)注射組10只，再按下列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分組。(3)參考Xiong等［1］的方法，免疫接種后30 d，建立結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HT－29→C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型(共10只，5只pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)注射的小鼠，5只pSVneo質(zhì)粒脾內(nèi)注射的小鼠)和肺轉(zhuǎn)移模型(共10只，5只pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)注射的小鼠，5只pSVneo質(zhì)粒脾內(nèi)注射的小鼠):調(diào)整HT－29細(xì)胞濃度為1×1010/L，取100 μL皮下注射(皮下移植瘤模型)或尾靜脈注射(肺轉(zhuǎn)移模型)。觀察小鼠精神、飲食、體重等變化及腫瘤生長情況。皮下移植瘤模型按下述公式繪制腫瘤生長曲線:腫瘤體積=腫瘤寬徑×腫瘤長徑×腫瘤長徑×0.5 mm3。腫瘤長徑大于20 mm時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，脫頸椎處死小鼠，腫瘤稱重，肺轉(zhuǎn)移模型計(jì)算肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)計(jì)算，腫瘤標(biāo)本及主要器官行病理檢查。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的資料采用獨(dú)立樣品的t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的資料采用兩個(gè)獨(dú)立樣品比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)轉(zhuǎn)染

pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)單次注射后，第4周脾組織即有SPTT－Ig H融合基因的強(qiáng)表達(dá)，PCR和Southern雜交分析均顯示強(qiáng)陽性，12周SPTT－Ig H表達(dá)強(qiáng)度開始下降，16周后SPTT－Ig H表達(dá)陰性，證實(shí)Ig H－SPTT融合基因按設(shè)計(jì)要求已成功轉(zhuǎn)染至脾細(xì)胞，并至少能維持3個(gè)月，見圖3。

2 間接ELISA對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的檢測(cè)

pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)注射后間接ELISA檢測(cè)外周血SPTT－Ig H的表達(dá)，可見質(zhì)粒轉(zhuǎn)染第2周外周血檢測(cè)即為陽性，其濃度為7.2 μg/L，第2周后濃度逐漸升高，第8周至高峰，達(dá)13.11 μg/L，隨后逐漸下降。pSVneo對(duì)照質(zhì)粒皮內(nèi)注射外周血一直未能檢測(cè)到SPTT－Ig H的存在，見表1。

3 pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)注射基因轉(zhuǎn)錄的組織分布

pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)注射后轉(zhuǎn)錄基因僅在脾組織有表達(dá)，第4周至第12周最明顯，第24周基本消退，與外周血檢測(cè)結(jié)果一致，淋巴結(jié)、骨髓、肝、肺、腎、肌肉、骨髓等組織未發(fā)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)染，見圖4。

Figure 3.The results of PCR(A)and Southern hybridization (B)for SPTT－Ig H expression after injection of pγ1.Ig H.SPTT recombinant plasmid into the spleen at different time points(0，4，12，16，24 and 36 weeks).According to the structure of plasmid DNA，3 pairs of primers were specifically designed for amplification of differentsegments(pCL/pCD，pSE/pNADand pNEL/pNED)，and［32P］－pNADoligonucleotide probes was used for Southern hybridization.β－actin was used as internal controls.圖3 PCR和Southern雜交檢測(cè)pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)注射后脾組織不同時(shí)點(diǎn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物SPTT-Ig H的表達(dá)情況

4 pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌的免疫效應(yīng)

pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌具有抑制作用。pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)注射組和pSVneo質(zhì)粒脾內(nèi)注射組各5只小鼠，手術(shù)和麻醉均成功，免疫接種后30 d開始建立皮下腫瘤移植模型，腫瘤移植成功率100%，腫瘤生長曲線和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤重量見圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)注射組平均腫瘤體積為(173.24±22.16) mm3，pSVneo質(zhì)粒脾內(nèi)注射組為(1 170.76± 106.08)mm3;pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)注射組平均瘤重為(0.32±0.07)g，pSVneo質(zhì)粒脾內(nèi)注射組為(1.09±0.46)g。

肺轉(zhuǎn)移模型10只小鼠均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，pSV－neo質(zhì)粒脾內(nèi)注射組的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)為69個(gè)，平均13.8個(gè)，pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)組為22個(gè)，平均4.4個(gè)，兩組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)相比有顯著差異(P＜0.01)，見表2。

表1 pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)注射后外周血轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物SPTT-Ig H的檢測(cè)Table 1.The content of transgene product SPTT－Ig H in the peripheral blood at different time points after intrasplenic inoculation of plasmid DNA pγ1.Ig H.SPTT in the mice(μg/L.Mean±SD.n=8)

Figure 4.The expression of pγ1.Ig H.SPTT recombinant plasmid in different tissues after injection into the spleen.A:the result of PCR;B:the Southern hybridization.圖4 pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)注射后轉(zhuǎn)染基因組織分布

Figure 5.The immune effect of pγ1.Ig H.SPTT recombinant plasmid intraplenic injection on colorectal cancer.A:tumor growth curve.The red line:tumor growth curve of the pγ1.Ig H.SPTT recombinant plasmid injection group;the blue line:tumor growth curve of the pSVneo plasmid injection group.B:the tumor weight in the end of the experiment.C:the sample of tumors in studies(the upper row is the pγ1.Ig H.SPTT plasmid injection group，and the lower row is the pSVneo plasmid injection group).Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs pSVneo.圖5 pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)注射對(duì)結(jié)直腸癌的免疫作用

表2 質(zhì)粒脾內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的抑制作用Table 2.Inhibitory effect of metastatic lung tumor formation by intrasplenic inoculation of plasmid DNA pγ1.Ig H.SPTT in the 5 mice

討論

CRC免疫治療的臨床實(shí)驗(yàn)已有陽性結(jié)果，2011年1篇涉及到2 031例CRC患者疫苗治療meta分析［13］報(bào)道自體瘤苗獲益率為46%，DC疫苗為17%，肽疫苗為13%。與這些疫苗相比，DNA疫苗具有“與自然感染相似、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)較強(qiáng)而持久、能引發(fā)聯(lián)合免疫及可反復(fù)使用”等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞［10］。DNA免疫不需要任何載體和佐劑，僅通過DNA質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)導(dǎo)體細(xì)胞就可以激發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)，被稱為疫苗的“第3次革命”［14］。至2010年止，有17篇CRC－DNA疫苗(CEA－DNA疫苗、5T4－DNA疫苗等)的Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道，獲益率為22%～41%，顯示DNA免疫對(duì)CRC具有應(yīng)用前景［15］。

STI產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的前提條件是外源DNA能有效地轉(zhuǎn)染至受體細(xì)胞。本項(xiàng)研究顯示，裸DNA質(zhì)粒單次脾內(nèi)注射即可以在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)獲得至少3個(gè)月的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，而且，轉(zhuǎn)錄基因具有高度表達(dá)能力，外周血外源蛋白濃度高峰時(shí)達(dá)到13.11 μg/L，說明脾臟是STI治療合適的接種部位。Gerloni等［2］研究結(jié)果初步表明，STI治療以脾臟為接種部位，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)基因蛋白表達(dá)水平比肌肉注射高100～1 000倍，單次注射既可獲得持久免疫應(yīng)答。Xiong等［1］探討了其機(jī)理，認(rèn)為STI脾內(nèi)注射能獲得有效轉(zhuǎn)染和高效表達(dá)的主要原因是外源質(zhì)粒能定向轉(zhuǎn)染至脾臟內(nèi)豐富的B淋巴細(xì)胞之故。外源DNA具有整合入周期活躍的細(xì)胞習(xí)性，脾B淋巴細(xì)胞受外源DNA刺激后有絲分裂活躍，處于周期活躍狀態(tài)，外源基因容易選擇性地持續(xù)感染B淋巴細(xì)胞。在本項(xiàng)研究中也證實(shí)，外源質(zhì)粒脾內(nèi)轉(zhuǎn)染具有定向性，pγ1.Ig H.SPTT重組質(zhì)粒脾內(nèi)注射后，除脾B淋巴細(xì)胞外，脾內(nèi)其它細(xì)胞、其它部位淋巴器官和非淋巴器官細(xì)胞均無轉(zhuǎn)導(dǎo)。定向轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與外源基因與B淋巴細(xì)胞具有同源性(均含免疫球蛋白H鏈基因)、脾B淋巴細(xì)胞受外源DNA刺激后有絲分裂活躍、轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒中附加了淋巴組織特異性調(diào)控成分等有關(guān)。Gerloni等［16］還更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，脾內(nèi)質(zhì)粒注射后外源基因是以附加體形式轉(zhuǎn)導(dǎo)于受體細(xì)胞核，未整合到受體細(xì)胞染色體，不會(huì)導(dǎo)致受體細(xì)胞突變。這些研究表明，脾內(nèi)注射是裸DNA免疫治療安全、有效的接種途徑。

利用基因工程技術(shù)將腫瘤特異性抗原的高親和肽段植入抗體超變環(huán)(CDR3環(huán))，可賦予轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物對(duì)腫瘤作用的靶向性［17］，pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染脾B淋巴細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄的表達(dá)產(chǎn)物SPTT－Ig H能誘導(dǎo)靶向性的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)。pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，能在B淋巴細(xì)胞水平表達(dá)具有天然構(gòu)象的、攜帶有腫瘤特異性抗原TF靶向片段的免疫球蛋白分子(SPTT－Ig H)，后者通過Fc受體與抗原提呈細(xì)胞MHC－Ⅱ分子結(jié)合，靶向性地提呈至腫瘤部位，與腫瘤表面膜受體TF結(jié)合后激發(fā)ADCC效應(yīng)，產(chǎn)生抗腫瘤免疫集焦效能，達(dá)到抗腫瘤免疫治療的目的［18］。而且，MHC－Ⅰ分子將植入肽段表達(dá)的靶向肽提呈給B淋巴細(xì)胞，使引發(fā)的免疫反應(yīng)具有持久性，產(chǎn)生一種類似抗腫瘤的“免疫記憶”效應(yīng)。

本項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也初步證實(shí)，pγ1.Ig H.SPTT質(zhì)粒脾內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)CRC具有免疫治療作用，雖然不能完全達(dá)到消滅腫瘤的目的，但可以明顯抑制CRC的生長，對(duì)CRC的肺部轉(zhuǎn)移也有抑制作用。TF同時(shí)表達(dá)在CRC血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面，以TF為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物能同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞和毀損腫瘤血管，我們?cè)?jīng)以腺病毒為載體構(gòu)建了一種以TF為靶點(diǎn)的免疫復(fù)合物質(zhì)粒，命名為Benc［12］，Benc攜帶有SPTT和免疫球蛋白效應(yīng)片段的融合基因，瘤內(nèi)注射和靜脈注射均能對(duì)CRC有較好的治療作用，但不可避免地帶來了腺病毒治療所產(chǎn)生的副作用，如肝腎功能損害等。本項(xiàng)目采用包含上述結(jié)構(gòu)的裸DNA疫苗進(jìn)行治療，可為抗腫瘤的靶向免疫治療帶來了一種新的思路。

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Immunosuppressive effect of naked DNA vaccine targeting tissue factor by intrasplenic inoculation on colorectal cancer

DENG Li，CHEN Cheng，HU Dan，ZENG Guang－zheng，MA Jing－sheng，RAO Ben－qiang

(Institute of Gastroenterology，Third Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.E-mail:benqiangrao@sina.com.cn)

AIM:To investigate the expression of objective gene and the immunosuppressive effect of naked DNA vaccine pγ1.Ig H.SPTT targeting tissue factor by intrasplenic inoculation on colorectal cancer(CRC).METHODS:A special naked DNA vaccine which carried the SPTT peptides and immunoglobulin H chain gene(named pγ1.Ig H.SPTT DNA plasmid)was constructed by molecular biological techniques.After a single injection of this plasmid into the spleen，the concentrations of transgene product SPTT－Ig H in the peripheral blood at different time points were detected by ELISA，and the plasmid transfection efficiency and characteristics were analysis by PCR and Southern blotting.The immunologic effect of the plasmid on the CRC was observed in the mice.RESULTS:The strongest expression of SPTT－Ig H was observed during the 4th week after a single injection of the plasmid，which began to decline at the 12th week and disappeared at the 16th week.The concentration of SPTT－Ig H in the peripheral blood at the 2nd week after transfection of plasmid was 7.2 μg/L，then increased gradually，and reached a peak of 13.11 μg/L at the 8th week.The plasmid－transcriptional gene was only expressed in the spleen，and was not detected in the lymph nodes，bone marrow，liver，kidney，and other organisms.Transfection of pγ1.Ig H.SPTT into the spleen had inhibitory effects on colorectal cancer as compared with control group.CONCLUSION:Naked DNA vaccine pγ1.Ig H.SPTT stimulates the immune response for protecting the body against colorectal cancer，which is a safe and effective method for CRC immunotherapy.

Tissue factor;Naked DNA vaccine;Colorectal cancer

R735.3+5;R392.32

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.018

1000－4718(2015)02－289－07

2014－08－06

2015－01－15

江西省衛(wèi)生廳資助課題(No.20132032)

△通訊作者Tel:0791－88864360;E－mail:benqiangrao@sina.com.cn