王一恬，張玲，沈微，楊海麟

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

低聚果糖(Fructooligosaccharide，F(xiàn)OS)是一類重要的低聚糖，進(jìn)入人體消化道后，不會被膽汁、胃酸、消化酶等分解吸收，可直達(dá)大腸中。腸道益生菌如雙歧桿菌、嗜酸性乳酸桿菌等可選擇性利用低聚果糖，獲得快速、大量繁殖，因此它是腸道益生菌的增殖因子［1－2］。果 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 (fructosyltransferase，EC 2.4.1.9，縮寫FTase)可催化蔗糖分子果糖基上的β-(2，1)糖苷鍵，結(jié)合1～3個果糖基，生成低聚果糖。低聚果糖主要包括蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)及其混合物等。果糖基轉(zhuǎn)移酶的主要來源包括兩方面:1)植物，如黑麥草、洋蔥等［3－4］;2)微生物，如真菌、細(xì)菌等［5－7］。植物來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶存在低含量等缺點(diǎn)，在低聚果糖工業(yè)生產(chǎn)中未被大規(guī)模采用。近年來，多種微生物(如絲狀真菌、酵母、節(jié)桿菌等)來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶被逐步發(fā)現(xiàn)并得到研究，但主要集中在對產(chǎn)酶微生物的篩選、酶純化、酶學(xué)性質(zhì)等初步研究［8－10］。本文采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，獲得黑曲霉(Aspergillus niger)YZ59的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因成熟酶區(qū)域(不含內(nèi)含子)。采用食品級表達(dá)宿主釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W3031A，成功異源表達(dá)了A.niger YZ59果糖基轉(zhuǎn)移酶。純化后，對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析與討論。該研究對果糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)及高純度低聚果糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

A.niger YZ59(CICIM F0901)保藏于中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心;S.cerevisiae W3031A、大腸桿菌(Escherichia coli)宿主菌株JM109、質(zhì)粒pYX212為本研究室保藏，其他質(zhì)粒均為實(shí)驗中構(gòu)建。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10;

SC-Ura培養(yǎng)基(g/L):酵母氮基6.7、葡萄糖20、亮氨酸 0.12、色氨酸 0.12、組氨酸 0.12、腺嘌呤0.12、瓊脂 15;

YPD培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物10、蛋白胨20、葡萄糖20。

1.3 果糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆及重組質(zhì)粒構(gòu)建

采用反轉(zhuǎn)錄酶III試劑盒(Invitrogen 18080-051)進(jìn)行RT-PCR，獲得A.niger果糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA。將已獲得的cDNA作為進(jìn)一步PCR的模板。PCR引物序列為:上游5’-CCGGAATTCATGAAGCTTCAAACGGCTTC-3’;下游5’-CGCGGATCCTTAGTGATGATGATGATGAGACTGACGATCCGGCCA-3’。引物兩端的限制性酶切位點(diǎn)(下劃線)分別為:EcoR I與BamH I。

PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pYX212均采用限制性內(nèi)切酶EcoR I與BamH I進(jìn)行酶切。采用連接酶，將酶切后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pYX212進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pYX212-fwt，測序驗證。采用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pYX212-fwt轉(zhuǎn)化宿主S.cerevisiae W3031A，利用尿嘧啶缺陷型平板(SC-Ura培養(yǎng)基)篩選，獲得產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶重組菌S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt。

1.4 酶液制備

在搖瓶(250 mL)中對重組菌 S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt進(jìn)行培養(yǎng)，30℃發(fā)酵48 h后，4℃下，8 000×g離心10 min，獲得菌體細(xì)胞。用相同體積的磷酸-檸檬酸緩沖液(pH 5.5)洗滌菌體細(xì)胞3次，再加入等體積的緩沖液混勻后，采用超聲破碎儀破碎細(xì)胞。4℃下，10 000×g離心10 min，獲得含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。

1.5 果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活測定

果糖基轉(zhuǎn)移酶的測定是通過HPLC方法測定反應(yīng)體系中蔗果三糖(GF2)的含量［11－12］。1個單位的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活定義為:每分鐘生成1 μmol GF2需要的酶量。

1.6 果糖基轉(zhuǎn)移酶純化

將“酶液制備”獲得的含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液，采用0.2 μm的膜過濾去除雜質(zhì)。由于果糖基轉(zhuǎn)移酶的C端含有His標(biāo)簽，實(shí)驗中采用Ni2+柱純化過濾后的酶液，蛋白純化儀為AKTA(GE，USA)。緩沖液A為含有20 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.4)。緩沖液B為含有250 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.4)。流速為1.0 mL/min?；诰€性洗脫(0～100% 緩沖液B)，收集目的樣品。

1.7 溫度和pH對果糖基轉(zhuǎn)移酶穩(wěn)定性的影響

酶最適溫度測定時的條件為:溫度范圍為30～70℃、底物為蔗糖、100 mmol/L磷酸－檸檬酸緩沖液(pH 5.5)。在不同溫度下測定的最高酶活力設(shè)為100%。研究過程中，分析了酶在40、50、60℃條件下的溫度穩(wěn)定性。在各溫度條件下，處理前的初始酶活力設(shè)為100%。

酶的最適pH是在不同pH條件下進(jìn)行分析的，如pH3.0～8.0(磷酸－檸檬酸緩沖液，100 mmol/L)。在不同pH條件下測定的最高酶活力設(shè)為100%。酶pH穩(wěn)定性測定的前處理條件為:不同pH緩沖液、25℃保溫24 h。采用的緩沖液為:磷酸－檸檬酸緩沖液(100 mmol/L，pH 3.0～8.0)、磷酸緩沖液(100 mmol/L，pH 8.0～9.0)、甘氨酸-NaOH 緩沖液(100 mmol/L，pH 9.0～11.0)。在不同pH緩沖液處理條件下，測得的最高殘留酶活力設(shè)為100%。

1.8 酶動力學(xué)參數(shù)測定

酶動力學(xué)參數(shù)測定條件為:磷酸－檸檬酸緩沖液(100 mmol/L，pH 5.5)、底物為蔗糖。底物濃度范圍為20～250 g/L。動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax均采用Lineweaver-Burk作圖法進(jìn)行計算。

1.9 金屬離子對酶的影響

為分析金屬離子對果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響，5 mmol/L 不同金屬離子(K+、Li+、Ba2+、Na+、Ca2+、Fe3+、Zn2+、NH4+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Ni2+)分別添加到果糖基轉(zhuǎn)移酶酶反應(yīng)體系中。以不添加金屬離子條件下測定的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力為100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及重組載體構(gòu)建

通過RT－PCR方式，獲得來源于A.niger YZ59(CICIM F0901)的果糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA。以該cDNA為模板，進(jìn)一步通過PCR方式獲得不含內(nèi)含子的果糖基轉(zhuǎn)移酶成熟序列fwt。采用限制性內(nèi)切酶EcoR I與BamHI進(jìn)行酶切，純化后，與質(zhì)粒pYX212連接，獲得重組質(zhì)粒pYX212－fwt(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pYX212-fwt的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmid pYX212-fwt

2.2 果糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)

將重組質(zhì)粒 pYX212-fwt轉(zhuǎn)化 S.cerevisiae W3031A，基于尿嘧啶缺陷型平板篩選，獲得產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶重組菌S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt。提取重組菌 S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt的基因組，以其為模板進(jìn)行PCR驗證，獲得已重組果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的陽性S.cerevisiae重組子。

將陽性S.cerevisiae重組子接種YPD培養(yǎng)基，30℃發(fā)酵56 h(圖2)。隨著發(fā)酵的逐步進(jìn)行，果糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵至48 h時，酶活達(dá)到最大，為19.8 U/mL。同時，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，重組S.cerevisiae的菌體濃度也逐漸增加。當(dāng)發(fā)酵至48 h時，菌體濃度達(dá)到最大，OD600=3.2。果糖基轉(zhuǎn)移酶也有在其他非食品級表達(dá)宿主中進(jìn)行異源表達(dá)的報道。例如，王玉海等將來源于米曲霉的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因在E.coli BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，25℃條件下，1.0 μmol/mL異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力達(dá)59.0 U/g［13］。

圖2 重組菌S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt產(chǎn)酶曲線Fig.2 Time profiles of FWT production by recombinant S.cerevisiae W3031A-pYX212-fwt

2.3 溫度對果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

如圖3A所示，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的最適反應(yīng)溫度為55℃。當(dāng)反應(yīng)溫度低于55℃時，隨著溫度的逐漸升高，F(xiàn)WT的酶活力逐漸增加。在最適反應(yīng)溫度(55℃)條件下，F(xiàn)WT的酶活力是30℃下酶活力的2.3倍。但高于55℃時，隨著反應(yīng)溫度的逐漸升高，F(xiàn)WT的酶活力迅速降低。70℃時，F(xiàn)WT的酶活力僅為55℃時酶活力的25.4%。對于果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的熱穩(wěn)定性，分別分析了酶在40、50、60℃下的穩(wěn)定性(圖3B)。在40℃下，處理60 min，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT基本不失活(酶活力殘留95%)，這說明其在該溫度條件下穩(wěn)定。在50℃下，處理60 min，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT酶活力殘留約為60%，這說明其在該溫度條件下也較穩(wěn)定。但果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT在60℃下，隨著處理時間的延長，酶活力迅速下降，甚至完全失活。由以上結(jié)果可以看出，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT具有良好的耐熱性。據(jù)報道，來源于米曲霉(A·oryzae)ZZ-01的果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT較果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的最適反應(yīng)溫度偏低10℃，為45℃［8］。

圖3 溫度對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity and stability of FWT

2.4 pH對果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的最適pH為5.5(圖4A)。當(dāng)pH＜5.5時(3.0～5.5)，隨著pH值的增加，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的相對酶活力逐漸增大。果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT在pH 5.5條件下的酶活力為pH 3.0條件下酶活力的4倍。但當(dāng)pH5.5時，隨著pH值的增加，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的相對酶活力迅速降低。如圖4B所示，分析了果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT在pH 2.0～11.0條件下的穩(wěn)定性。在pH 6.0條件下，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT最為穩(wěn)定。在pH 4.0～9.0條件下，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的穩(wěn)定性較高(酶活殘留90%)。由此可確定，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT具有較寬的pH穩(wěn)定范圍。據(jù)報道，洋蔥來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶FST-1在pH低于或高于5.5時，酶活力迅速降低，甚至完全失活［4］。

圖4 pH對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on the activity and stability of FWT

2.5 果糖基轉(zhuǎn)移酶的動力學(xué)參數(shù)

基于Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，以蔗糖為反應(yīng)底物，分別對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax進(jìn)行分析。如圖5所示，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的Km值和Vmax值分別為169.5 g/L和0.7 g/(L·min)。果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的kcat值和kcat/Km值分別為9.8 ×103min－1和57.8 L/(g·min)。

圖5 果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.5 Lineweaver-Burk plots for using sucrose as substrate by FWT

2.6 金屬離子對果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

為了分析金屬離子對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT酶活力的影響，測定了5 mmol/L濃度下不同金屬離子(K+、Li+、Ba2+、Na+、Ca2+、Fe3+、Zn2+、NH4+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Ni2+)對酶活力的影響關(guān)系。如圖6所示，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT可顯著被Ni2+和Mg2+激活。添加5 mmol/L Ni2+和Mg2+時，果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的酶活力分別為對照的112.3%和106.3%。同時，5 mmol/L K+和Fe3+也對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT有一定的激活作用。5 mmol/L Ba2+和Cu2+對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT具有顯著的抑制作用。金屬離子可以影響酶結(jié)構(gòu)的正確折疊，進(jìn)而影響酶的酶活力。不同金屬離子對果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力具有不同的激活或抑制作用。例如，Ca2+可激活來自萵苣的果糖基轉(zhuǎn)移酶，但其活性卻受Zn2+和 Cu2+的抑制［14］。

圖6 金屬離子對果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT酶活力的影響Fig.6 Effect of metal ions on the activity of FWT

3 結(jié)論

本研究通過RT-PCR獲得了A.niger來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因，成功在S.cerevisiae中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，并對純化后酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測定、分析。果糖基轉(zhuǎn)移酶在S.cerevisiae中無需誘導(dǎo)即可進(jìn)行異源表達(dá)，發(fā)酵48 h后，最高酶活力可達(dá)19.8 U/mL。對該重組果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的性質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，酶在低于50℃的條件下穩(wěn)定。果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT的最適pH為5.5，具有較寬的pH穩(wěn)定范圍。果糖基轉(zhuǎn)移酶 FWT的 Km、Vmax、kcat、kcat/Km分別為 169.5 g/L、0.7 g/(L·min)、9.8×103min－1、57.8 L/(g·min)。Ni2+和 Mg2+可顯著激活果糖基轉(zhuǎn)移酶FWT。S.cerevisiae作為食品級表達(dá)宿主，具有食品安全等優(yōu)點(diǎn)，后期將對S.cerevisiae高效生產(chǎn)重組果糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)控與優(yōu)化研究。

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