王娜，國石磊，張永祥，彭利沙，李軍

1(河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北秦皇島，066600)2(河北省果品加工工程技術(shù)研究中心，河北秦皇島，066600)

醋酸桿菌是一類重要的工業(yè)用菌，在食品和飲料工業(yè)生產(chǎn)以及工業(yè)化學(xué)品的生物轉(zhuǎn)化中都起著重要作用［1］。

低溫冷凍保藏是一種長期保藏菌種的簡便方法。菌懸液中加入適當(dāng)保護(hù)劑放于冰箱中保存，一般－20℃下能保藏1年左右，－70℃下保藏時間更長，可達(dá)到10年以上，此保藏方法簡單易行，適合實(shí)驗室保藏菌種［2］。而冷凍干燥保藏菌種的方法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般活力強(qiáng)的微生物及其孢子以及無芽孢菌都適用，適用于菌種的長期保存，一般可保存數(shù)年至十余年。

保護(hù)劑無論對生物體還是生物大分子都有良好的非特異性保護(hù)作用，能夠顯著降低工藝處理中冷凍、干燥等逆境對菌體細(xì)胞膜、脂質(zhì)體等造成的傷害，提高菌種存活率［3］。采用合適的保護(hù)劑加以深冷技術(shù)能有效地保藏菌種，制備發(fā)酵劑［4］。國內(nèi)外關(guān)于保護(hù)劑在乳酸菌中的保護(hù)作用已有大量的研究，并且對各種保護(hù)劑的效果也有大量的數(shù)據(jù)報道［5－11］，但是針對醋酸菌保護(hù)劑的研究較少。研究表明，不是每種保護(hù)劑對所有菌種都有保護(hù)作用，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大小都存在差異，不同微生物即使采用相同的保護(hù)劑所取得的效果也不盡相同［12］，不同的保護(hù)劑所發(fā)揮的效果具有菌株特異性的特點(diǎn)。

糖醇類物質(zhì)是一類重要的保護(hù)劑，它們的共同點(diǎn)是有大量自由羥基，可與菌表面自由基聯(lián)結(jié)，形成保護(hù)膜，從而避免菌體暴露在介質(zhì)中，還可與蛋白質(zhì)形成氫鍵以取代水，保證蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［13］。同時糖醇類物質(zhì)也可以降低冰晶體對菌體細(xì)胞的破壞作用，有利于細(xì)胞較快復(fù)水或修復(fù)受損細(xì)胞［14］。海藻糖作為一種廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物及很多無脊椎動物細(xì)胞內(nèi)的非還原性二糖，具有高親水、化學(xué)穩(wěn)定的獨(dú)特性質(zhì)［15］。除此以外，常用作糖類保護(hù)劑的還有葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、葡聚糖等。高分子保護(hù)劑，如脫脂奶粉等溶于水時，溶液可呈過冷狀態(tài)，即在冰點(diǎn)以下的相同溫度該溶液中的溶質(zhì)濃度較小，蛋白質(zhì)鹽析變性也較少［16］。脫脂奶粉是一種較好的保護(hù)劑，其主要成分是蛋白質(zhì)和糖類，特別是其中的乳清蛋白和乳糖能對菌種產(chǎn)生較好的保護(hù)作用，能以“包埋”的形式將菌體與外界不利環(huán)境隔離，減少由于細(xì)胞壁損壞而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而起到保護(hù)作用。

為了考察不同保護(hù)劑對醋酸菌菌體細(xì)胞的保護(hù)作用，本文以醋化醋桿菌和巴氏醋桿菌巴士亞種為研究對象，比較10種不同的保護(hù)劑對它們的冷凍和冷干保護(hù)作用，為進(jìn)一步研發(fā)保護(hù)劑配方提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

醋化醋桿菌(Acetobacter aceti，CICC 22519)，巴氏醋桿菌巴士亞種(Acetobacter pasteurianus ssp.pasteurianus，CICC7015)，均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體活化培養(yǎng)基:葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，蒸餾水100 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，蒸餾水100 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，Mg-SO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水100 mL，pH 自然，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 保護(hù)劑

葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、可溶性淀粉、葡聚糖、玉米糊精均為分析純試劑和生化試劑。脫脂乳粉為市售奶粉。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

FDU-1200型冷凍干燥機(jī)，日本EYELA東京理化;VOS301SD型真空干燥箱，日本EYELA東京理化;蒸汽滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱和潔凈工作臺等實(shí)驗室常用儀器設(shè)備。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 菌懸液制備

為確保實(shí)驗的一致性，每次培養(yǎng)前均從固體斜面培養(yǎng)上接種活化，30℃、170 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h。隨后以10%接種量再次接入液體培養(yǎng)基，如前，培養(yǎng)24 h。所得到的液體種子培養(yǎng)物接種于100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)36 h至細(xì)胞穩(wěn)定期。在無菌條件下，將培養(yǎng)物等量分裝于10 mL無菌離心管中，5 000 r/min離心10 min，迅速傾去上清液，收集細(xì)胞，用冷的磷酸緩沖溶液(pH 7.0)洗滌2次，再次離心收集。所得的菌體細(xì)胞加入等量的不同保護(hù)劑和磷酸緩沖溶液中，用渦旋混合器充分混勻后進(jìn)行冷凍或冷干處理。

1.2.2 保護(hù)劑制備

將各種保護(hù)劑按要求用蒸餾水溶解，配制成質(zhì)量濃度為10%的溶液，113℃滅菌40 min后備用。

1.2.3 菌體存活率測定

菌體存活率:稀釋平板計數(shù)法，樣品經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)稀釋后涂布于固體瓊脂培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個重復(fù)，平皿置30℃培養(yǎng)48 h后菌落計數(shù)。

1.2.4 冷凍

經(jīng)過不同保護(hù)劑懸浮的菌懸液置于－20℃下凍存12 h，室溫解凍后測定活菌數(shù)。

1.2.5 冷凍干燥

添加有不同保護(hù)劑的菌懸液均分裝于10 mL無菌離心管中，置冷凍干燥機(jī)中處理24 h。測定活菌數(shù)前先用磷酸緩沖溶液對處理后的樣品定量復(fù)水。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同保護(hù)劑對菌體細(xì)胞冷凍的保護(hù)作用

為了研究不同保護(hù)劑對醋酸菌的冷凍保護(hù)能力，我們研究了冷凍處理后不同保護(hù)劑的作用，結(jié)果如圖1所示。對所得實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表1、表2。

圖1 不同保護(hù)劑對菌體細(xì)胞冷凍保護(hù)作用的比較Fig.1 Effect of different protectants on cell after freezing

表1 A.aceti冷凍保護(hù)劑的方差分析結(jié)果(n=3)Table 1 Variance analysis of the freezing protectants on A.aceti(n=3)

表1、表2的方差分析結(jié)果表明，不同保護(hù)劑對A.aceti和A.pasteurianus ssp.pasteurianus的冷凍保護(hù)效果的影響顯著性概率值均為P=0.000＜0.05，表明不同保護(hù)劑對A.aceti和 A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷凍存活率的影響顯著(P＜0.05)。采用Duncan新復(fù)極差法對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行的多重比較結(jié)果見表3。

表2 A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷凍保護(hù)劑的方差分析結(jié)果(n=3)Table 2 Variance analysis of the freezing protectants on A.pasteurianus ssp.pasteurianus(n=3)

表3 冷凍保護(hù)劑的Ducan多重比較結(jié)果(n=3)Table 3 Multiple comparison of the freezing protectants(n=3)

從表3可看出，對于醋化醋桿菌菌株，可溶性淀粉和葡聚糖這2種保護(hù)劑的保護(hù)效果不佳，顯著低于磷酸緩沖液對照，其他的所選保護(hù)劑均要顯著高于對照的保護(hù)效果。海藻糖、玉米糊精和脫脂乳粉對醋化醋桿菌的冷凍保護(hù)作用最為突出，存活率均超過了50%，分別達(dá)到了73.58%、62.26%和60.38%，比緩沖溶液對照的24.53%提高了3倍左右。并且海藻糖、玉米糊精、脫脂乳粉之間也存在顯著差異(P＜0.05)，保護(hù)效果:海藻糖＞玉米糊精＞脫脂乳粉。

對于巴氏醋桿菌巴氏亞種菌株，10種不同的保護(hù)劑中，除了甘露醇的保護(hù)效果與緩沖溶液對照無顯著差異，其他9種保護(hù)劑的保護(hù)效果均顯著高于緩沖溶液對照。葡聚糖、脫脂乳粉、玉米糊精和海藻糖的冷凍保護(hù)效果則較為顯著，存活率分別達(dá)到了95.35%、89.53%、88.37%和52.32%，與緩沖溶液對照的2.33%相比分別提高了41倍、38倍、38倍和22倍。葡聚糖、脫脂乳粉、玉米糊精同海藻糖之間保護(hù)效果差異顯著(P＜0.05)，保護(hù)效果:葡聚糖＞脫脂乳粉＞玉米糊精＞海藻糖。

從圖1看出，小分子保護(hù)劑中海藻糖對兩種菌株的冷凍保護(hù)作用最好，而高分子保護(hù)劑中脫脂乳粉和玉米糊精都對2種菌株均有較好的保護(hù)效果。冷凍過程對細(xì)胞膜的破環(huán)主要在于胞內(nèi)外冰晶的形成和對細(xì)胞膜透性的影響。冰晶形成后，細(xì)胞質(zhì)中鹽濃度升高，造成胞內(nèi)pH和離子強(qiáng)度改變，潛在的不利化學(xué)反應(yīng)發(fā)生率提高［17］。研究表明，海藻糖具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、抗逆保護(hù)的作用［18］。在添加保護(hù)劑的情形下，冷凍過程中大量冰晶形成，體系中的可冷凍水含量降低，使保護(hù)劑的局部濃度大大提高，糖的玻璃化相轉(zhuǎn)變溫度從而提高，極易形成玻璃態(tài)，而處于玻璃態(tài)的體系往往更加穩(wěn)定，不容易發(fā)生物理化學(xué)變化。在相同的條件下，海藻糖與其他糖類相比，顯示了最高的玻璃化相轉(zhuǎn)變溫度［19］。從這個層面上講，海藻糖更易形成玻璃態(tài)，這種玻璃態(tài)假說可能可以解釋其對細(xì)胞的冷凍保護(hù)作用。而高分子保護(hù)劑中，脫脂奶粉和玉米糊精的保護(hù)效果較好，其主要是在細(xì)胞表面起到保護(hù)作用，通過“包埋”形式保護(hù)菌體。

相比較2種菌株，在未加保護(hù)劑的情況下，冷凍對于巴氏醋桿菌巴士亞種的傷害更大，緩沖溶液對照組中，其存活率僅有2.33%，而醋化醋桿菌的對照存活率達(dá)到了24.53%，近似高出了10倍。并且海藻糖(二糖)對醋化醋桿菌菌株效果最好，玉米糊精、脫脂乳粉(大分子)效果次之;巴氏醋桿菌巴士亞種菌株則相反，葡聚糖、脫脂乳粉、玉米糊精等大分子的保護(hù)效果最佳，而海藻糖的效果次之。推測造成這些保護(hù)劑效果的差異可能是由于不同屬的菌株特性不同，培養(yǎng)過程中醋化醋桿菌的菌液比較黏稠，可能有較多的胞外多糖分泌，其本身的大分子物質(zhì)對其菌株產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用，這可能也是其未加保護(hù)劑能達(dá)到較高存活率的原因之一，因此小分子糖類對其的保護(hù)作用更顯著;而巴氏醋桿菌巴士亞種分泌的多糖相對較少，所以大分子的包埋保護(hù)作用顯得更明顯一些。這些推測還要靠進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

2.2 不同保護(hù)劑對菌體細(xì)胞冷凍干燥的保護(hù)作用

冷凍干燥對細(xì)胞造成損傷的主要原因在于:冰晶形成、鹽濃度改變、細(xì)胞膜透性改變和代謝作用損傷。而保護(hù)劑在冷凍干燥過程中的保護(hù)作用，主要是其具有能與水結(jié)合、阻止胞內(nèi)和胞外冰晶形成的能力。冷凍干燥處理后不同保護(hù)劑的作用結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同保護(hù)劑對菌體細(xì)胞冷干保護(hù)作用的比較Fig.2 Effect of different protectants on cell after freeze-drying

對所得實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表4、表5。

表4 A.aceti冷干保護(hù)劑的方差分析結(jié)果(n=3)Table 4 Variance analysis of the freeze-drying protectants on A.aceti(n=3)

表5 A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷干保護(hù)劑的方差分析結(jié)果(n=3)Table 5 Variance analysis of the freeze-drying protectants on A.pasteurianus ssp.pasteurianus(n=3)

表4、表5的方差分析結(jié)果表明，不同保護(hù)劑對A.aceti和A.pasteurianus ssp.pasteurianus的冷干保護(hù)效果的影響顯著性概率值均為P=0.000＜0.05，表明不同保護(hù)劑對A.aceti和A.pasteurianus ssp.pasteurianus冷干存活率的影響顯著(P＜0.05)。采用Duncan新復(fù)極差法對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行的多重比較結(jié)果見表6。

從表6可以看出，對于醋化醋桿菌菌株，甘露醇、蔗糖、海藻糖同緩沖溶液對照的效果差異不顯著，其他的7種保護(hù)劑存在顯著差異。脫脂乳粉、乳糖、葡萄糖的保護(hù)效果較好，凍干存活率分別為92.86%、81.25%、46.88%，分別是對照的4.2倍、3.7倍和2.1倍。并且這三者之間也存在顯著差異(P＜0.05)，保護(hù)效果:脫脂乳粉＞乳糖＞葡萄糖。

表6 冷干保護(hù)劑的Ducan多重比較結(jié)果(n=3)Table 6 Multiple comparison of the freeze-drying protectants(n=3)

對巴氏醋桿菌巴士亞種菌株，葡萄糖、乳糖、麥芽糖與對照樣品比較差異不顯著，其余7種保護(hù)劑有顯著差異。脫脂乳粉和海藻糖的冷干保護(hù)效果較優(yōu)，分別是對照的6倍和2.6倍，兩者之間差異顯著(P＜0.05)，凍干存活率:脫脂乳粉(72.92%)＞海藻糖(31.25%)。

從圖2可以明顯看出，脫脂乳粉對醋化醋桿菌和巴氏醋桿菌巴士亞種的冷凍干燥保護(hù)效果均是最好的。這是因為在干燥過程中，乳粉中的乳清蛋白能在菌體外形成蛋白衣保護(hù)層，對細(xì)胞加以保護(hù)，并且可以固定凍干的酶類，避免由于細(xì)胞壁蛋白質(zhì)損壞而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，同時乳中的其他成分，如乳糖等，同樣可以起到一定的抗逆保護(hù)作用。而海藻糖在冷干過程中的保護(hù)作用對巴氏醋桿菌巴士亞種比醋化醋桿菌顯著，表明不是每種保護(hù)劑對所有菌株都有明顯保護(hù)效果，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大小都有所不同，對于不同菌株，即使采用相同的保護(hù)劑所取得的效果也有差異，所以需要實(shí)驗來加以確定。

3 結(jié)論

(1)對菌體冷凍處理后，小分子保護(hù)劑中以海藻糖對兩個菌株的保護(hù)效果最為顯著，大分子保護(hù)劑中玉米糊精、脫脂乳粉以及葡聚糖呈現(xiàn)出較好的保護(hù)效果，這4種保護(hù)劑可優(yōu)先用于對這2個菌種的冷凍保護(hù)劑的進(jìn)一步優(yōu)化研究。

(2)對菌體冷凍干燥處理后，脫脂乳粉對2個菌株的保護(hù)作用最好，其次乳糖、葡萄糖和海藻糖也起到一定的保護(hù)效果，這4種保護(hù)劑可用于下一步這2個菌株的冷干保護(hù)劑配方研究。

(3)每種保護(hù)劑對不同菌株的保護(hù)效果不同，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和大小都有所不同，即使采用相同的保護(hù)劑所取得的效果也有差異，所以每一種保護(hù)劑對每一醋酸菌菌株的存活率的影響都應(yīng)該逐一確定。

(4)不同的保藏方法，每種保護(hù)劑起到的作用也不盡相同，要根據(jù)具體的工藝條件確定保護(hù)劑。

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