石 歆

(河南中醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院 內(nèi)科，河南 鄭州450000)

膠質(zhì)瘤是常見中樞神經(jīng)細(xì)胞原發(fā)性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率。糖原合酶激酶-3(Glycogen Synthase Kinase-3β，GSK-3β)有GSK-3α 和GSK-3β 兩種亞型，其功能失調(diào)與糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的病理進(jìn)程息息相關(guān)[1-3]。GSK-3β是GSK-3 研究較多的亞型，越來越多的研究表明，GSK-3β 與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4-5]。如GSK-3β 在乳腺癌中異?；罨种破浔磉_(dá)后乳腺癌細(xì)胞的增殖力明顯下降，同時細(xì)胞凋亡率增加[4]。但是，GSK-3β 在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用尚不清楚。因此，本研究體外分析GSK-3β 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，同時探討GSK-3β對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲的影響及作用機(jī)制，從而為進(jìn)一步明確GSK-3β 在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系:正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞1800(Sciencell 公司);人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172、T98G、U87 和U251(ATCC 公司)。

1.1.2 試劑:新生牛血清(華美生物工程有限公司);RPMI 1640 培養(yǎng)基(Hyclone 公司);DMEM 培養(yǎng)基、Trizol 和cDNA 合成試劑盒(Invitrogen 公司);噻唑藍(lán)(MTT)(北京索萊寶科技有限公司);Lipofectamine 2000(Sigma 公司);抗人GSK-3β、PAX3 及Ki67的抗體(Cell Signaling Technology);實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒(TaKaRa 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng):將正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞1800和T98 膠質(zhì)瘤細(xì)胞置于RPMI 1640 培養(yǎng)液中，3～4 d換一次液。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172、U87 和U251 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中，所有細(xì)胞均置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 GSK-3β 重組表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)已知人GSK-3β 序列設(shè)計(jì)相應(yīng)表達(dá)引物，具體為:上游，5'-G CGAATTCCGAAGAGAGTGATCATGTCAG-3'，含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(斜體);下游，5'-CGCTCGAGGGCTGCTC GGGACTGTTCAGG-3'，含XhoⅠ酶切位點(diǎn)(斜體)。以本實(shí)驗(yàn)室前期合成的人一鏈cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后連接到酶切好的pcDNA3.1(+)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-GSK-3β(rGSK-3β)。將構(gòu)建的GSK-3β 重組載體經(jīng)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染人U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞，設(shè)置載體對照組(vector)和未處理組。

1.2.3 PAX3 siRNA轉(zhuǎn)染:將U87 細(xì)胞接種于12 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞增殖達(dá)到70%～80%匯合時，用無血清DMEM 稀釋細(xì)胞。將制備的100 nmol/L siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物采用LipofetamineTM2000 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果評估。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組、scramble siRNA(NC)組和PAX3 siRNA轉(zhuǎn)染組。PAX3 siRNA 序列為:上游，5'-CGC AUCCUGAGAAGUAAAUdTdT-3';下游，5'-AUUUAC UUCUCAGGAUGCGdTdT-3';scramble siRNA 序列為:上游，5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3';下游，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。所 用 序列均由上海生工合成。

1.2.4 RNA的提取和cDNA 合成:Trizol 提取上述處理細(xì)胞的總RAN，一鏈cDNA 合成按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 操作說明書進(jìn)行。

1.2.5 實(shí)時定量RT-PCR:GSK-3β 引物序列為(上游5'-AGTGGTGAGAAGAAAGATGAG-3';下游，3'-TGACATAAATCACAGGGAG-5');PAX3的引物序列為(上游，5'-CCGACTTGGAGAGGAAGGA-3';下游，5'-CATCTGATTGGGGTGCTGA-3')。具體按操作SYBR 熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.6 Western blot 分析:采用細(xì)胞裂解液裂解不同處理組細(xì)胞，BCA 試劑盒分析蛋白濃度。加入約25 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，半干轉(zhuǎn)法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上。加入5%脫脂奶粉，4℃過夜;TBST 洗滌后分別加入抗人GSK-3β、PAX3 一抗和HRP 標(biāo)記的二抗。用ECL 顯影，β-actin 為內(nèi)參。

1.2.7 MTT 測細(xì)胞增殖:按2×104個/孔將細(xì)胞接種于96孔板中，各組處理方法如前。待培養(yǎng)板重復(fù)吸收上清后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，4 h后加入150 μL DMSO。低速振蕩10 min 使結(jié)晶物充分溶解，將樣品置于酶標(biāo)儀上測定490 nm 處A值。

1.2.8 Transwell 分析細(xì)胞的侵襲能力:將Transwell小室用預(yù)熱的無血清培養(yǎng)基處理15～30 min;取200 μL 不同處理組無血清細(xì)胞懸液接種于上腔室，下室加入700 μL 含10%胎牛血清的DMEM，室溫下培養(yǎng)24 h。取Transwell 膜，洗滌2次后用4%多聚甲醛固定25 min，HE染色后顯微鏡下隨機(jī)選取9個視野進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GSK-3β 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)

與正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞1800 相比，4種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GSK-3βmRNA 水平明顯增高，且GSK-3β在U87 中的mRNA 水平約是1800 細(xì)胞的3.64倍(P＜0.05)(圖1A)。此外，與1800 細(xì)胞相比，上述4種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GSK-3β的表達(dá)水平明顯增加(圖1B)。

圖1 GSK-3β 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig1 The expression levels of GSK-3β in glioma cells

2.2 rGSK-3β轉(zhuǎn)染效果

rGSK-3β轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中rGSK-3β的蛋白水平明顯高于對照組(圖2A)，約是對照組的3.45倍(P＜0.05)(圖2B)。

圖2 rGSK-3β轉(zhuǎn)染效果評估Fig2 Effect of rGSK-3β transfection

2.3 GSK-3β對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

與對照組和空載體處理組相比，GSK-3β過表達(dá)后細(xì)胞的存活率明顯增加(圖3A)(P＜0.05)，同時細(xì)胞增殖標(biāo)記分子Ki67 蛋白明顯增加(圖3B)(P＜0.05)。

2.4 GSK-3β對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響

GSK-3β過表達(dá)后侵出小室的細(xì)胞數(shù)目明顯高于對照組和載體處理組(P＜0.05)(圖4)。

2.5 GSK-3β對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PAX3表達(dá)水平的影響

GSK-3β過表達(dá)后U87 細(xì)胞中PAX3的mRNA水平明顯增高，約是對照組的3.2倍(P＜0.05)(圖5A);同時伴隨有PAX3 蛋白水平的上調(diào)(圖5B)(P＜0.05)。

2.6 PAX3 在GSK-3β 介導(dǎo)的細(xì)胞增殖及侵襲中的作用

與control 和NC組相比，PAX3 siRNA轉(zhuǎn)染明顯U87 細(xì)胞中PAX3的蛋白水平(圖6A 和6B)(P＜0.05)。同時GSK-3β過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率(圖6C)和侵襲細(xì)胞的數(shù)目明顯降低明顯下降(圖6D)(P＜0.05)。

圖3 GSK-3β對U87 細(xì)胞增殖的影響Fig3 Effect of GSK-3β on cell proliferation

圖4 GSK-3β對U87 細(xì)胞侵襲能力的影響Fig4 Effect of GSK-3β on cell invasion

圖5 GSK-3β對細(xì)胞中PAX3表達(dá)水平的影響Fig5 Effect of GSK-3β on PAX3 expression

圖6 PAX3 在GSK-3β 介導(dǎo)的細(xì)胞增殖及侵襲中的作用Fig6 Function of PAX3 on GSK-3β-induced cell proliferation and invasion

3 討論

近年來，越來越多研究證明，GSK-3β 不僅參與糖尿病、炎性反應(yīng)及阿爾茨海默病等疾病的進(jìn)程，還與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。但是，GSK-3β 在膠質(zhì)瘤中的作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究證實(shí)，與正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞1800 相比，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172、T98、U87 和U251 細(xì)胞中GSK-3β的表達(dá)明顯增高，提示GSK-3β 在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

已知膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲在膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，是影響患者預(yù)后和存活的關(guān)鍵。目前為止，對GSK-3β 在腫瘤發(fā)展中的作用有兩種截然不同的觀點(diǎn)，有研究表明，GSK-3β 具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及腫瘤發(fā)展進(jìn)程的作用[6，8];也有研究證實(shí)GSK-3β 具有抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在作用[9]。為進(jìn)一步分析GSK-3β 在膠質(zhì)瘤中的功能，成功構(gòu)建了GSK-3β過表達(dá)細(xì)胞模型。GSK-3β過表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力明顯增加，同時伴隨有侵襲細(xì)胞數(shù)目的增加，表明GSK-3β 具有促膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲的潛能。

PAX3是已知的調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，近年來發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤組織中高表達(dá)，與黑素瘤、橫紋肌肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤等腫瘤的發(fā)展息息相關(guān)[6，10]。近期研究表明，PAX3 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平較高，與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及腫瘤發(fā)生有關(guān)[11]。此外，GSK-3 能夠上調(diào)PAX3的水平，從而有利于人黑素瘤細(xì)胞的存活及生長[6]。本研究證實(shí)，GSK-3β過表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PAX3的水平。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PAX3 沉默后GSK-3β過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞的增殖能力明顯下降，同時侵襲細(xì)胞的數(shù)目降低，提示GSK-3β 可能通過調(diào)控PAX3 來影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲進(jìn)程。

綜述所述，本研究證實(shí)了GSK-3β 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用及其分子機(jī)制。因此，本研究將為新型抗膠質(zhì)瘤藥物的研制提供新的研究方向。

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