陳國(guó)鋒，蔡國(guó)軍，李國(guó)鋒，王介川，鄭樹森

(浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院1.附屬第一醫(yī)院 肝膽胰外科;2.附屬第二醫(yī)院 濱江院區(qū) 普外科，浙江 杭州310003;3.杭州市蕭山區(qū)第四人民醫(yī)院 普外科，浙江 杭州311225)

中國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，目前全國(guó)已有超過(guò)3，000萬(wàn)的乙型肝炎患者。相當(dāng)一部分乙肝患者發(fā)展為肝硬化及肝癌[1]。肝移植一直是終末期肝病患者的唯一治療途徑[2]。由于同種異體免疫排斥反應(yīng)的存在，研究如何誘導(dǎo)和維持免疫耐受一直是器官移植領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[3-4]。

越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，具有免疫調(diào)節(jié)作用的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)能夠下調(diào)宿主內(nèi)對(duì)移植物的排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)器官移植物的存活時(shí)間，在免疫耐受形成的過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[5]。免疫耐受與肝移植術(shù)后宿主內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量及表型的變化密切相關(guān)。但很多文獻(xiàn)也沒(méi)有闡述該變化的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)旨在探究小鼠肝移植術(shù)后，移植物的排斥反應(yīng)和移植物內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和表型隨時(shí)間變化的規(guī)律，為揭示免疫耐受的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:清潔級(jí)雄性C57Bl/6 小鼠16只，Balb/c小鼠48只，8～12周齡，體質(zhì)量24～29 g?！舱憬?shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證:SCXK(浙)2014-0001〕。

1.1.2 主要試劑:肝臟保存液(UW 液)，反轉(zhuǎn)錄酶(Sigema 公司)，SYBN 實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(Takara公司)，抗CD3、B220 和Foxp3 單克隆抗體(Abcam 公司)，抗CLAT-4 FITC 熒光抗體(eBioscience 公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝移植模型建立:供肝植入時(shí)，用“套袖法”完成門靜脈、肝下下腔靜脈重建，用支架法重建膽管。

1.2.2 動(dòng)物分組:實(shí)驗(yàn)組行異基因肝移植，C57Bl/6-Balb/c 肝移植;對(duì)照組行同基因肝移植，Balb/c-Balb/c肝移植。術(shù)后3、7、14 和28 d 分別取肝臟固定或液氮保存，部分用于提取分離調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型鑒定。

1.2.3 HE染色及排斥活性指數(shù)評(píng)定:將肝臟標(biāo)本進(jìn)行HE染色。按照Banff 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表1)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)肝臟組織切片進(jìn)行排斥活性指數(shù)的評(píng)定。RAI 0～2 分定為無(wú)排斥;3 分為不確定性改變;4～5分為輕度排斥(Ⅰ級(jí));6～7 分為中度排斥(Ⅱ級(jí));8～9 分為重度排斥(Ⅲ級(jí))。

1.2.4 免疫組化染色:用抗CD3、B220 及Foxp3 單克隆抗體對(duì)肝臟切片標(biāo)本行免疫組化染色，并高倍鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Foxp3表達(dá):Trizol提取肝臟組織總RNA，測(cè)定含量并計(jì)濃度，采用Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄法，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用熒光定量PCR 試劑進(jìn)行擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，采用2－△△Ct法進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型改變:利用膠原蛋白酶IV 對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行消化，采用全自動(dòng)免疫磁珠分選系統(tǒng)對(duì)肝臟內(nèi)的Treg 進(jìn)行分離提取，利用抗CLAT-4-FITC 抗體對(duì)Treg 進(jìn)行染色后，經(jīng)BD Laser Ⅱ型流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件(V 16.0)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后移植肝的排斥反應(yīng)

同基因組小鼠移植肝臟病理切片可見肝內(nèi)炎性反應(yīng)較輕，術(shù)后第3 天達(dá)到高峰，至第7天左右基本恢復(fù)正常。異基因組的小鼠則發(fā)生了明顯的急性排斥反應(yīng):術(shù)后第7天排斥反應(yīng)達(dá)到高峰，后逐漸消退，至28天，基本恢復(fù)至正常(圖1)。對(duì)兩組移植肝的標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，結(jié)果在移植后早期(移植后3 d)，兩組移植肝內(nèi)均有一定量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)且數(shù)量相當(dāng)，隨后，異基因移植肝總的浸潤(rùn)細(xì)胞顯著增多，并在移植后7 d 達(dá)到高峰(表2)。

表1 肝移植后急性排斥反應(yīng)的排斥活性指數(shù)(RAI)Table1 Rejection activity index(RAI)of acute rejection after liver transplantation

圖1 移植肝內(nèi)組織切片F(xiàn)ig1 Post-operative rejection in liver graft(×200)

表2 同、異基因組肝移植術(shù)后病理學(xué)排斥評(píng)分Table2 RAI in isogenic and allogeneic graft after liver transplantation(RAI)

2.2 移植物內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的類型

T 淋巴細(xì)胞是異基因移植肝內(nèi)浸潤(rùn)的主要淋巴細(xì)胞類型(圖2)。

2.2 移植肝內(nèi)Foxp3 陽(yáng)性T細(xì)胞的改變

移植術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的異基因移植肝內(nèi)Foxp3 陽(yáng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主要分布于移植肝臟的匯管區(qū)(圖3A，B);術(shù)后第3 天Foxp3 陽(yáng)性細(xì)胞開始增多，第7～14 天逐漸達(dá)到高峰期，第14 天后逐漸下降并趨于穩(wěn)定維持在相對(duì)較高的水平。同基因組移植肝內(nèi)則未見明顯Foxp3 陽(yáng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的改變(圖3C)。

圖2 移植肝內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞免疫組化染色Fig2 Infiltrating lymphocytes in liver graft(×400)

圖3 移植肝內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)增加Fig3 Alteration of Foxp3-positive T cells count and Foxp3-mRNA level in liver graft (×400)

異基因組移植肝內(nèi)Foxp3 mRNA表達(dá)水平在術(shù)后逐漸升高，第14 天達(dá)到高峰，隨后下降并穩(wěn)定維持存在。同基因組移植物內(nèi)Foxp3 mRNA表達(dá)則無(wú)明顯改變(圖3D)。

2.4 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面CTLA-4的改變

移植術(shù)后14 d，異基因移植組的移植肝、脾和移植物引流淋巴結(jié)中的Tregs 比例均較同基因移植組明顯升高(圖4)。

圖4 同、異基因移植組術(shù)后14 天的移植肝、脾臟和引流淋巴結(jié)中Tregs的比例Fig4 Ratios of Tregs cells in graft liver，spleen，drainage lymph nodes in Allogeneic graft and isogeneic graft

異基因移植肝內(nèi)浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面CTLA-4表達(dá)顯著高于同基因組，且在移植后移植保持較高表達(dá)水平(P＜0.05)(圖5)。

圖5 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面CTLA-4表達(dá)增加Fig5 CTLA-4 Expression alteration on regulating T cells

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在移植免疫排斥反應(yīng)中發(fā)揮著作用，同時(shí)也參與到移植物免疫耐受的形成[6]。臨床及基礎(chǔ)研究均發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg 細(xì)胞能夠誘導(dǎo)移植免疫耐受的形成[7-8]。Foxp3 也被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的重要標(biāo)志性分子[9]。

本研究在同基因和異基因肝移植模型術(shù)后，兩組的炎性反應(yīng)的時(shí)間及程度的不同;術(shù)后浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞主要為T 淋巴細(xì)胞，其中Foxp3 陽(yáng)性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及Foxp3 mRNA的變化也與移植物中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的變化一致;流式細(xì)胞術(shù)分析可見調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面的CTLA-4 也隨著Foxp3的改變而出現(xiàn)相應(yīng)變化。

上述免疫排斥反應(yīng)隨時(shí)間的變化規(guī)律與Foxp3 mRNA的變化規(guī)律及Foxp3 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的變化規(guī)律互相吻合，這也說(shuō)明了異基因肝移植術(shù)后發(fā)生了針對(duì)同種異體抗原的急性免疫排斥反應(yīng)，并在第7天后逐漸達(dá)到高峰，與此同時(shí)Foxp3 mRNA的表達(dá)逐漸上調(diào)，F(xiàn)oxp3表達(dá)量上升，促使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育和活化;在術(shù)后第14 天左右，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量逐漸達(dá)到高峰，隨著其負(fù)向調(diào)節(jié)功能的增強(qiáng)，免疫排斥反應(yīng)開始逐漸減弱，浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞開始逐漸下降;至術(shù)后28 天左右，移植物內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞明顯減少，排斥活性指數(shù)下降至正常提示移植肝達(dá)到免疫耐受，此后可見少量調(diào)節(jié)性T細(xì)胞持續(xù)存在于移植肝匯管區(qū)，以維持免疫耐受的穩(wěn)態(tài)。

CTLA-4 與B7 分子結(jié)合后可誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)，參與免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)[10]。我們的研究發(fā)現(xiàn)移植術(shù)后隨著Foxp3表達(dá)的增高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面的CTLA-4的表達(dá)也達(dá)到高峰提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的活化;此后，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面的CTLA-4則穩(wěn)定存在，也提示在耐受期，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞仍然發(fā)揮作用，維持免疫耐受狀態(tài)的穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)異基因肝移植術(shù)后，肝臟內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與了機(jī)體對(duì)移植物排斥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，并最終導(dǎo)致移植肝免疫耐受，為下一步揭示移植物內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)何種機(jī)制誘導(dǎo)移植物耐受提供了很好的研究基礎(chǔ);同時(shí)也為將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)工具應(yīng)用于器官移植領(lǐng)域提供了理論依據(jù)。

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