李晨

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)內(nèi)分泌科，山東 青島 266000)

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山茱萸對(duì)大鼠糖尿病腎病的作用

李晨

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)內(nèi)分泌科，山東 青島 266000)

目的 探討山茱萸對(duì)糖尿病大鼠糖尿病腎病的影響及機(jī)制。方法 采用腹腔注射鏈脲佐菌素方法構(gòu)建糖尿病模型，將Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組、山茱萸小劑量(400 mg·kg-1·d-1)干預(yù)組及山茱萸大劑量(800 mg·kg-1·d-1)干預(yù)組和氟伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。造模20周后檢測(cè)各組大鼠腎臟體質(zhì)量比(K/B)，血漿肌酐、尿素氮和尿酸的含量，腎小管間質(zhì)谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)含量，腎組織骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)、Smad3、Smad5、Smad7、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB) mRNA表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠腎臟K/B增高，血漿肌酐、尿素氮和尿酸的含量增高，腎組織BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、ROS、MCP-1和NF-κB表達(dá)上調(diào)，GSH表達(dá)下調(diào)，差異均有顯著性(F=8.16～127.30，P<0.05)。與糖尿病組比較，小劑量和大劑量山茱萸干預(yù)組大鼠腎臟K/B、血漿肌酐、尿素氮和尿酸含量下降，BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、ROS、MCP-1和NF-κB表達(dá)下降，GSH表達(dá)增加，差異均有顯著性(q=2.842～243.400，P<0.05)。結(jié)論 山茱萸可抑制糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)損傷，降低氧化應(yīng)激可能是其作用機(jī)制。

山茱萸；糖尿病腎病；氧化性應(yīng)激

糖尿病是一種以血糖升高為特征的代謝性疾病，長(zhǎng)期血糖升高可累及其他臟器的微管系統(tǒng)，包括眼、腎臟和神經(jīng)[1]。糖尿病腎病是糖尿病病人的常見(jiàn)并發(fā)癥，主要癥狀包括持續(xù)性大量清蛋白尿、腎病綜合征、腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)下降，并最終導(dǎo)致腎衰竭。降低血糖，控制和治療并發(fā)癥是治療糖尿病的主要目標(biāo)[2-3]。臨床研究結(jié)果顯示，山茱萸可顯著降低糖尿病病人血糖水平，同時(shí)在改善病人臨床癥狀，減緩腎衰竭和降低尿蛋白方面具有顯著效果[4-5]。NADPH氧化酶是糖尿病腎病發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一，其導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可影響腎臟細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及腎臟血管通透性，與糖尿病腎病密切相關(guān)[6]。本文觀察山茱萸通過(guò)下調(diào)糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，對(duì)糖尿病大鼠腎臟纖維化水平的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量為(200±10)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；鏈脲佐菌素、雙氫羅丹明-123，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；氟伐他汀購(gòu)自諾華制藥有限公司；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活力檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)含量檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；核蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；血漿肌酐、尿素氮和尿酸檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Siemens公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本KaTaRa公司。

1.2糖尿病動(dòng)物模型構(gòu)建

雄性Sprague-Dawley大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N組)、糖尿病組(D組)、山茱萸低劑量組(FC-L組)、山茱萸高劑量組(FC-H組)及氟伐他汀組(Flu組)，每組10只。大鼠腹腔按55 mg/kg劑量注射鏈脲佐菌素構(gòu)建糖尿病大鼠模型，F(xiàn)C-L組大鼠按400 mg/(kg·d)灌胃給山茱萸，F(xiàn)C-H組大鼠按800 mg/(kg·d)灌胃給山茱萸，F(xiàn)lu組作為陽(yáng)性對(duì)照組按20 mg/(kg·d)灌胃給Flu組，N組和D組給予等體積生理鹽水，共喂養(yǎng)12周。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1大鼠腎臟體質(zhì)量比(K/B) 大鼠處死后，稱量大鼠體質(zhì)量(BW)，剪取左腎，稱取其質(zhì)量(KW)，計(jì)算K/B。K/B=KW×2/BW。

1.3.2肌酐、尿素氮和尿酸含量 斷頭處死大鼠，用抗凝管收集血液，顛倒混勻，4 ℃ 下以3 000 r/min離心10 min，取血漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肌酐、尿素氮和尿酸含量。

1.3.3腎臟組織中活性氧(ROS)和GSH的表達(dá)①將大鼠腎臟組織剪碎，篩網(wǎng)過(guò)濾，收集游離細(xì)胞，加入1 μmol/L雙氫羅丹明-123，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2條件下孵育2 h，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下ROS表達(dá)。②腎臟細(xì)胞經(jīng)液氮和37 ℃水浴快速凍融2次，離心，取上清按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定GSH含量。

1.3.4大鼠腎臟組織中NF-κB、BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β和MCP-1的mRNA水平將大鼠腎臟組織經(jīng)TRIZOL法提取總RNA，按以下序列進(jìn)行擴(kuò)增。NF-κB上游引物：5′-GAAGAAG-CGAGACCTGGAG-3′，下游引物：5′-TCCGGAAC-ACAATGGCCAC-3′；BMP-7上游引物：5′-TCCGA-TTCCCTGCCCAAGTG-3′，下游引物：5′-AGGCCG-TCTTCAGTACCCAGG-3′；Smad3上游引物：5′-G-CAGAACGTCAACACCAAGTGC-3′，下游引物：5′-GTGCAGGTCTGGCCATCGC-3′；Smad5上游引物：5′-AATGAATTGTATCCTGCCGGTA-3′，下游引物：5′-TAAACAATCGTGTTGGGGAAGC-3′；Smad7上游引物：5′-CCATCACCTTAGCCGACTCT-3′，下游引物：5′-GCAAAAGCCATTCCCCTGAG-3′；TGF-β上游引物：5′-CCCAGCATCTGCAAAGCTC-3′，下游引物：5′-GTCAATGTACAGCTGCCGCA-3′；MCP-1上游引物：5′-TTGACCCGTAAATCTGAA-GCTAAT-3′，下游引物：5′-TCACAGTCCGAGTC-ACACTAGTTCAC-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCTA-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGAC-3′。檢測(cè)各組大鼠腎臟組織中NF-κB、BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β和MCP-1的mRNA水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠K/B比較

D組大鼠的K/B與N組比較明顯增高，F(xiàn)C-H組、Flu大鼠的K/B均較D組顯著下降，差異有顯著性(F=8.16，P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠血漿中肌酐、尿素氮和尿酸含量比較

D組大鼠的肌酐、尿素氮和尿酸含量與N組比較明顯增高，差異有顯著意義(F=80.36～109.70,P<0.05)；山茱萸及Flu干預(yù)后，大鼠的肌酐、尿素氮和尿酸含量均顯著下降,與FC-L組比較，F(xiàn)C-H組的下降更顯著,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=2.842～27.210,P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組大鼠腎臟組織中ROS、GSH表達(dá)比較

D組大鼠的ROS表達(dá)與N組比較明顯增高，GSH表達(dá)降低，差異有顯著意義(F=95.78、22.88,P<0.05)；山茱萸及Flu干預(yù)后，ROS表達(dá)顯著下降,GSH表達(dá)升高，與FC-L組比較，F(xiàn)C-H組變化更顯著(q=2.148～23.420,P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4各組大鼠腎臟組織中BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB mRNA表達(dá)比較

D組大鼠的BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB mRNA表達(dá)與N組比較均明顯增高，差異有顯著意義(F=42.45～127.30，P<0.05);山茱萸及Flu干預(yù)后，大鼠以上各指標(biāo)均顯著下降，與FC-L組比較，F(xiàn)C-H組下降更顯著(q=3.748～243.400,P<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討 論

糖尿病是一種以血糖升高為特征的慢性代謝性疾病，糖尿病腎病是常見(jiàn)并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致病人腎衰竭。研究表明，高糖血癥和高脂血癥可引起氧化應(yīng)激，ROS及其引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可以觸發(fā)Smad/TGF-β和NF-κB/AKT信號(hào)通路，上調(diào)BMP-7和MCP-1，從而引起腎臟的炎癥損傷和纖維化，導(dǎo)致血管和微管系統(tǒng)細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起腎臟功能的不可逆損傷[7-12]。

表1 各組大鼠K/B及血漿肌酐、尿素氮和尿酸相對(duì)含量

表2 各組大鼠腎臟組織ROS及GSH表達(dá)

表3 各組BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB mRNA表達(dá)

山茱萸味酸、澀，微溫，歸肝、腎經(jīng)，能補(bǔ)益肝腎，滋陰補(bǔ)氣。大部分糖尿病病人屬于氣陰兩虛型病癥，所以山茱萸可用于治療糖尿病。臨床研究顯示，山茱萸可有效改善胰島素抵抗，降低血糖，改善糖尿病腎病的癥狀，是一種可有效治療糖尿病的天然產(chǎn)物[13-14]。血肌酐、尿素氮和尿酸分別為含氮的有機(jī)物、蛋白質(zhì)代謝和嘌呤代謝的終末產(chǎn)物。在腎功能正常的情況下，其可從腎小球?yàn)V出，當(dāng)糖尿病損傷腎臟使腎小球?yàn)V過(guò)率下降時(shí)，血肌酐、尿素氮和尿酸迅速升高，表示腎功能已嚴(yán)重?fù)p害。Flu作為廣泛使用的降脂藥物，在多個(gè)研究中被作為陽(yáng)性對(duì)照，因此本文將Flu組作為陽(yáng)性對(duì)照觀察山茱萸對(duì)大鼠糖尿病腎病的治療作用。

本文研究結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠的K/B、血肌酐、尿素氮和尿酸含量以及ROS表達(dá)與N組比較明顯增高，GSH表達(dá)降低，差異有顯著性；與D組比較，山茱萸及Flu干預(yù)后，大鼠的K/B、血肌酐、尿素氮和尿酸含量以及ROS表達(dá)均顯著下降，而GSH表達(dá)增高；且與FC-L組比較，F(xiàn)C-H組的變化更顯著，差異有顯著性。提示山茱萸可能通過(guò)降低氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮生物學(xué)作用。

本文結(jié)果還顯示，糖尿病模型組大鼠的BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β mRNA與N組比較明顯增高。與D組比較，山茱萸及Flu干預(yù)后，以上各指標(biāo)均顯著下降；且與FC-L組比較，F(xiàn)C-H組的下降更顯著，提示山茱萸可通過(guò)調(diào)節(jié)BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腎臟的炎癥和纖維化。因此，推測(cè)山茱萸抑制腎臟損傷與間質(zhì)纖維化的機(jī)制是抑制BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β信號(hào)通路及其下游蛋白的表達(dá)。

綜上所述，山茱萸可有效治療大鼠糖尿病腎病，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

EFFECT OF FRUCTUS CORNI ON DIABETIC NEPHROPATHY IN RATS

LIChen

(Department of Endocrinology, Qilu Hospital of Shandong University, Qingdao 266000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Fructus Corni on diabetic nephropathy in rats and its mechanism.MethodsA diabetic model of rats was created using intraperitoneal injection of Streptozotocin, and 40Sprague-Dawleyrats were randomized to four equal groups: normal control group, diabetes group, low-dose Fructus Corni group (400 mg·kg-1·d-1), and high-dose Fructus Corni group (800 mg·kg-1·d-1). Twenty weeks after modelling, the following items were detected in rats of each group: kidney to body weight ratio (K/B), plasma creatinine, urea nitrogen and uric acid; the levels of glutathione (GSH) and reactive oxygen species (ROS) in rat kidney cells; the expressions of bone morphogenetic protein-7 (BMP-7), Smad3, Smad5, Smad7, transforming growth factor-β (TGF-β), Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1) and nuclear transcription factor-κB (NF-κB).ResultsCompared with the normal group, rats in the diabetes group showed significant increase in K/B, plasma levels of ROS, creatinine, urea nitrogen and uric acid, up-regulation of expressions of BMP-7, Smad3, Smad5, Smad7, TGF-β, ROS, MCP-1 and NF-κB in renal tissue, and down expression of GSH (F=8.16-127.30,P<0.05). Compared with the diabetes group, rats in the low-dose and high-dose Fructus Corni groups, K/B, plasma levels of creatinine, urea nitrogen and uric acid, and the expressions of BMP-7, Smad3, Smad5, Smad7, TGF-β, ROS, MCP-1 and NF-κB declined, and the expression of GSH up-regulated (q=2.842-243.400,P<0.05).ConclusionFructus Corni can relieve damage of renal tubular interstitial in diabetic rats, reducing oxidative stress may be its mechanism of action.

fructus corni; diabetic nephropathies; oxidative stress

2015-03-27;

2015-07-26

李晨(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師。

R587.24

A

1008-0341(2015)06-0674-04