張永軍，薛莉，魏梅，謝安木

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 神經(jīng)內(nèi)科； 2 康復(fù)科； 3 內(nèi)分泌科)

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·論著·

SynphiLin-1 siRNA對6-OHDA誘導(dǎo)帕金森病大鼠黑質(zhì)區(qū)NF-κB表達(dá)影響

張永軍1，薛莉2，魏梅3，謝安木1

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 神經(jīng)內(nèi)科； 2 康復(fù)科； 3 內(nèi)分泌科)

目的 研究SynphiLin-1 siRNA對6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的大鼠黑質(zhì)區(qū)核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)表達(dá)的影響，探討SynphiLin-1及NF-κB在帕金森病(PD)炎性發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 選擇Wistar大鼠36只,隨機(jī)分成4組，每組9只，分別向大鼠左側(cè)黑質(zhì)致密部注入6-OHDA、SynphiLin-1 siRNA、抗壞血酸生理鹽水及siRNA作為PD組、siRNA組、陽性對照組、siRNA對照組。采用免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)、SynphiLin-1及NF-κB表達(dá)，并進(jìn)行比較。結(jié)果 與陽性對照組比較，PD組大鼠黑質(zhì)區(qū)SynphiLin-1、NF-κB陽性細(xì)胞顯著增加，TH陽性細(xì)胞數(shù)下降；與PD組比較，siRNA組大鼠黑質(zhì)區(qū)NF-κB、SynphiLin-1陽性細(xì)胞明顯減少，TH陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，差異均有顯著性(F=8.6～14.8，P<0.05)。siRNA組TH陽性細(xì)胞數(shù)與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 SynphiLin-1可能是6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)重要上游調(diào)節(jié)蛋白，與NF-κB相互作用，參與PD發(fā)病的神經(jīng)炎性過程。

SynphiLin-1；NF-κB；羥多巴胺；帕金森??；酪氨酸單氧化酶

帕金森病(PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前普遍認(rèn)為是遺傳易感性和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。PD主要的病理改變?yōu)楹谫|(zhì)路易體(LB)的形成和神經(jīng)元的缺失。SynphiLin-1是構(gòu)成LB 的主要成分，有研究表明SynphiLin-1可能在PD的發(fā)病中具有重要意義[1-4]。已有研究證實(shí)，PD和阿爾茨海默病(AD)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病有相似的發(fā)病機(jī)制，神經(jīng)炎癥反應(yīng)均介導(dǎo)疾病的發(fā)生與發(fā)展，而且核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的主要的信號通路，其激活與AD的發(fā)病有關(guān)[5-6]。在PD發(fā)生過程中，SynphiLin-1是否參與NF-κB表達(dá)調(diào)控以及二者之間表達(dá)的關(guān)系尚不清楚。本研究基于NF-κB信號通路探討SynphiLin-1在PD發(fā)病機(jī)制中的作用，以期為PD防治藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

選擇清潔級健康成年雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量200～220 g，購自青島實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件：室溫(25±2)℃，自然光照，單籠喂養(yǎng)，自由飲食。6-羥基多巴胺(6-OHDA)(美國Sigma公司)；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體(武漢博士德公司)；一抗TH、SynphiLin-1(美國Chemicon公司)；免疫組織化學(xué)SABC試劑盒購自武漢博士德公司。SynphiLin-1 siRNA反義鏈：5′-dTdTGCUGCUCUUGCC-UUUGUUA-3′，正義鏈：5′-CGACGAGAACGGAA-ACAAU-3′；陰性對照siRNA正義鏈：5′-AUAGUC-ACACAGGCAUGACdTdT-3′，反義鏈：3′-dTdUAU-CAGUGUGUCCGUACUG-5′，均由廣州銳博生物工程有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型的建立Wistar大鼠隨機(jī)分為陽性對照組(A組)、PD組(B組)、siRNA組(C組)、siRNA對照組(D組)，每組9只。大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛(30 mg/kg)麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上，參照PAXINOS等[7]方法確定左側(cè)黑質(zhì)致密部(SNc)坐標(biāo):前囟后4.8 mm，矢狀縫左側(cè)1.7 mm，硬腦膜下7.5 mm。PD組：應(yīng)用微量注射泵在大鼠左側(cè)SNc注入6-OHDA 18 μg(溶于含2 g/L抗壞血酸生理鹽水3 μL中)，注射速度為0.5 μL/min，術(shù)畢留針10 min，隨后連續(xù)2 d注入含2 g/L抗壞血酸生理鹽水6 μL；siRNA組:大鼠左側(cè)SNc連續(xù)2 d注入1 nmol(3 μL)SynphiLin-1 siRNA，第3天注入6-OHDA 3 μL；siRNA對照組：大鼠左側(cè)SNc注入siRNA 3 μL，隨后連續(xù)2 d注入2 g/L抗壞血酸生理鹽水3 μL；陽性對照組：左側(cè)SNc連續(xù)3 d注入2 g/L抗壞血酸生理鹽水3 μL，局部消毒常規(guī)縫合切口。所有大鼠每日腹腔注射青霉素10萬單位預(yù)防感染，在第10天時(shí)處死。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測 用100 g/L水合氯醛麻醉大鼠并固定在木板上，用40 g/L多聚甲醛灌注液快速灌注固定、斷頭并分離出中腦，置于40 g/L多聚甲醛中固定4～6 h，石蠟包埋，4 μm厚切片，置于60 ℃烤箱中烘烤30 min，依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性、抗原修復(fù)等步驟。加入1∶4 000的TH一抗(SynphiLin-1一抗1∶200，NF-κB一抗1∶200)于玻片上，陰性對照用PBS代替一抗。DAB顯色，顯微鏡下適時(shí)終止顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。高倍鏡(200倍)下隨機(jī)取5個(gè)視野觀察、攝片，采用德國KONTRONIBAS 2.0全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，分別計(jì)數(shù)SynphiLin-1、TH、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析

納入大鼠36只，造模過程中死亡3只，進(jìn)入結(jié)果分析33只，其中陽性對照組9只，PD組8只，siRNA組8只，siRNA對照組8只。

2.2各組黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)量比較

陽性對照組黑質(zhì)區(qū)可見大量的TH陽性神經(jīng)元，且排列整齊，呈條帶狀；與陽性對照組比較，PD組TH陽性神經(jīng)元數(shù)量減少54.5%；與PD組大鼠比較，siRNA組TH陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，差異有顯著意義(F=12.4，P<0.05);siRNA對照組TH陽性神經(jīng)元數(shù)量與PD組比較差異無顯著意義(P>0.05)。見表1。

2.3各組黑質(zhì)區(qū)SynphiLin-1和NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)量比較

與陽性對照組比較，PD組黑質(zhì)區(qū)SynphiLin-1和NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加；與PD組大鼠比較，siRNA組黑質(zhì)區(qū)SynphiLin-1和NF-κB陽性細(xì)胞顯著減少,差異均有顯著意義(F=14.8、8.6，P<0.05)；siRNA對照組黑質(zhì)區(qū)SynphiLin-1和NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)與PD組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組黑質(zhì)區(qū)TH、SynphiLin-1和NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)比較

3 討 論

PD是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理改變是中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失。近年研究顯示，神經(jīng)炎癥所介導(dǎo)的神經(jīng)毒性在PD的發(fā)生發(fā)展過程中起到非常重要的作用，是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡的決定因素。諸多研究結(jié)果表明，抑制神經(jīng)炎癥具有神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[8]。因此，抗炎藥物防治PD的研究日益受到人們的關(guān)注。NF-κB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的生理病理過程。NF-κB通過調(diào)控多種與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞損傷、炎癥導(dǎo)致的氧化應(yīng)激及依賴于細(xì)胞因子的毒性作用，可能會(huì)導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體通路變性，從而加速PD的進(jìn)展。有研究結(jié)果顯示，PD發(fā)生時(shí)存在小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、炎癥因子的聚集、NF-κB通路的激活及氧化應(yīng)激損傷等[9]。本研究采用6-OHDA立體定向毀損大鼠黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元制備偏側(cè)PD模型，以黑質(zhì)TH蛋白表達(dá)反映多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量和功能狀態(tài)。本文結(jié)果顯示，與陽性對照組比較，PD組TH陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，提示6-OHDA可能激活炎性因子NF-κB，破壞多巴胺能神經(jīng)元，進(jìn)而參與PD的發(fā)病過程。既然NF-κB作為炎性因子參與PD的發(fā)病過程，那么研究NF-κB表達(dá)的調(diào)控影響因素，對探討多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制有重要意義。

SynphiLin-1蛋白主要表達(dá)于腦組織中，表達(dá)量隨著年齡的增加而增加[10]。研究表明，SynphiLin-1與α-synucLein相互作用能夠明顯促進(jìn)包涵體的形成[11]，在一些神經(jīng)變性疾病神經(jīng)細(xì)胞包涵體中都發(fā)現(xiàn)了SynphiLin-1蛋白的表達(dá)。也有研究結(jié)果顯示，SynphiLin-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的沉積使SynphiLin-1轉(zhuǎn)基因鼠表現(xiàn)出了運(yùn)動(dòng)損傷[12]。提示SynphiLin-1作為α-synucLein的伴侶蛋白之一，在PD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究應(yīng)用SynphiLin-1 siRNA阻斷SynphiLin-1基因的表達(dá)，探討其對NF-κB表達(dá)的影響及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的作用。結(jié)果顯示，PD組與陽性對照組比較，NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，TH陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，但siRNA組(即阻斷SynphiLin-1基因表達(dá)組)與PD組比較，NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，TH陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，表明阻斷SynphiLin-1基因的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)6-OHDA處理的大鼠黑質(zhì)區(qū)NF-κB表達(dá)的上調(diào)和TH表達(dá)的下調(diào)，提示SynphiLin-1可能與NF-κB存在相互作用；阻斷SynphiLin-1基因表達(dá)能夠抑制NF-κB表達(dá)和活化，從而減低其介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)，從而間接增強(qiáng)了大鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元對神經(jīng)毒性物質(zhì)6-OHDA的抵御能力。

綜上所述，NF-κB作為炎性因子參與PD的發(fā)病過程，SynphiLin-1可能與NF-κB相互作用，SynphiLin-1 siRNA的阻斷效應(yīng)抑制了NF-κB信號通路的激活，最終抑制NF-κB所調(diào)控的多種炎性因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但SynphiLin-1是通過何種機(jī)制影響NF-κB信號通路尚有待于進(jìn)一步研究。

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(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

THE EFFECT OF SYNPHILIN-1 SIRNA ON THE EXPRESSION OF NF-κB IN SUBSTANTIA NIGRA OF PARKINSON DISEASE RAT MODEL INDUCED BY 6-HYDROXYDOPAMINE

ZHANGYongjun,XUELi,WEIMei,XIEAnmu

(Department of Neurology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the effect of SynphiLin-1 on expression of nuclear factor kappa B (NF-κB) in substantia nigra (SN) in rats induced by 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) and explore SynphiLin-1 and NF-κB in the inflammatory pathogenesis of Parkinson’s disease (PD).MethodsThirty-sixWistarrats were equally randomized to four groups and injected into left substantia nigra (SN) with 6-OHDA, SynphiLin-1 siRNA, ascorbic plus normal saline and siRNA of rats in PD group, siRNA group, positive control group and siRNA control group, respectively. Immunohistochemical method was used to detect and compare the expressions of tyrosine hydroxylase (TH), SynphiLin-1 and NF-κB in the SN.ResultsCompared with the positive control group, the number of positive NF-κB and SynphiLin-1 cells in the PD group increased, and that of positive TH cells decreased; compared with PD group, the number of positive NF-κB and SynphiLin-1 cells in siRNA group decreased, and that of TH cells increased (F=8.6-14.8,P<0.05). No statistical difference was noted in the number of positive TH cells between siRNA group and positive control group (P>0.05).ConclusionSynphiLin-1 might be an important upstream regulatory protein in inflammatory reaction in substantia nigra of midbrain in rat induced by 6-OHDA, which interacts with NF-κB and involves in the pathogenesis of Parkinson’s disease and its process of neuritis.

SynphiLin-1; NF-kappa B; oxidopamine; Parkinson disease; tyrosine 3-monooxygenase

2015-04-29;

2015-08-18

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2012CM028)

張永軍(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師。

謝安木(1966-)，男，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。

R742.5

A

1008-0341(2015)06-0658-03