趙無恙,劉 韜,錢其軍,

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018; 2.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院病毒治療實驗室,上海 200438)

紅色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠胚胎干細(xì)胞系建立及體內(nèi)成瘤的初步研究

趙無恙1,劉 韜2,錢其軍1,2

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018; 2.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院病毒治療實驗室,上海 200438)

建立能夠穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光的小鼠胚胎干細(xì)胞系,并研究其在體內(nèi)不同部位形成畸胎瘤的能力。構(gòu)建含紅色熒光蛋白(DsRed-Express)的表達(dá)質(zhì)粒,并采用磷酸鈣法包裝成慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)。篩選得到強(qiáng)陽性克隆,對其進(jìn)行RT-PCR檢測和裸鼠、C57小鼠體內(nèi)成瘤實驗驗證細(xì)胞特性,最后獲得穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光的胚胎干細(xì)胞(Red-ESCs)。Red-ESCs能夠表達(dá)多能性基因,如Oct4,Sox2,Nanog等,也能在裸鼠體內(nèi)成瘤。不同部位的畸胎瘤在基因表達(dá)上有差異,其中肝部形成的畸胎瘤表達(dá)肝特性基因。成功建立穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光的小鼠胚胎干細(xì)胞系,其在體內(nèi)形成的畸胎瘤性質(zhì)受到體內(nèi)環(huán)境的影響。

胚胎干細(xì)胞; 紅色熒光蛋白; 畸胎瘤; 肝特異性基因

0 引 言

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)是一類原始的未分化細(xì)胞,來自早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)或桑椹胚,具有最高級的發(fā)育全能性,理論上在合適的條件下可以分化出成體動物的所有組織和器官(包括生殖細(xì)胞),因此研究前景十分廣闊[1]。但是胚胎干細(xì)胞在應(yīng)用過程中還面臨著成瘤的風(fēng)險。根據(jù)“胚巢理論”,即認(rèn)為惡性腫瘤的最初來源是體內(nèi)殘存的胚胎性細(xì)胞[2]。受非胚胎環(huán)境的影響,殘存于正常組織中的胚胎性細(xì)胞會惡變形成腫瘤干細(xì)胞,這是惡性腫瘤發(fā)生并且持續(xù)惡化的原因之一。

因為ESCs的研究比較多地集中在體外分化和體內(nèi)細(xì)胞組織修復(fù),對ESCs做相應(yīng)的標(biāo)記可以更好地觀察ESCs的體外分化,及追蹤其在體內(nèi)參與組織修復(fù)的過程。利用熒光物質(zhì)示蹤是人們對分子水平進(jìn)行觀察時普遍采用的工具,已經(jīng)有報道通過給ESCs標(biāo)記綠色熒光觀察分化和發(fā)育情況[3-4]。紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)發(fā)現(xiàn)自珊瑚綱下動物的一類標(biāo)記物,可與綠色熒光蛋白共用,其激發(fā)和發(fā)射波長更長,具有發(fā)光效率高、耐光性強(qiáng)、細(xì)胞內(nèi)成像背景低、對多pH值耐受力強(qiáng)的優(yōu)點[5-6],在實際應(yīng)用中可以起到與綠色熒光互補(bǔ)的作用,為細(xì)胞內(nèi)的多色標(biāo)記提供更多的熒光標(biāo)記。

為了更好追蹤胚胎干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)的變化,筆者利用攜帶DsRed-Express的慢病毒轉(zhuǎn)染C57小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs),獲得了可以穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的胚胎干細(xì)胞系(Red-ESCs)。RT-PCR檢測和體內(nèi)成瘤實驗的結(jié)果均證明Red-ESCs全能分化性未受到明顯影響。其次,將Red-ESCs注入C57小鼠的不同部位(皮下,腹腔和肝部),觀察其形成腫瘤的能力,研究體內(nèi)不同微環(huán)境對胚胎干細(xì)胞的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

293T細(xì)胞(美國菌種保藏中心),裸鼠、C57小鼠(中國科學(xué)院上海實驗動物中心);Kod DNA Polymerase、cDNA合成試劑盒、SYBR? Realtime PCR Master Mix試劑盒購自Toyobo;DMEM-H、DMEM/F12、FBS、Neurobasal Medium、L-Glutamine、2-hydroxy-1-ethanethiol、N2、B27、Chir99021、PD0325901、SU5402購自Gibco公司;其余為國產(chǎn)分析純試劑;引物合成均為上海Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DsRed-Express表達(dá)載體構(gòu)建及慢病毒包裝

以pLV120-hMR為模板PCR得DsRed片段,上游引物為:CTA GCTAG C TAG ATGG CCTCCTCCGA,下游引物為:TGG TGGACAAGGA CATC CTTAAG CGG,應(yīng)用NheI和EcoRI雙酶切連入慢病毒表達(dá)載體PLV120-EF1α,得到DsRed-Express。

采用三質(zhì)粒磷酸鈣轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的方法獲得攜帶標(biāo)記基因的慢病毒。質(zhì)粒準(zhǔn)備:應(yīng)用QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Purification試劑盒大量抽取DsRed-Express、psPAX2和pMD2.G,經(jīng)分光光度法準(zhǔn)確定量后按照3∶2∶1的質(zhì)量比混合均勻。細(xì)胞準(zhǔn)備:將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞培養(yǎng)在10% FBS的無抗生素DMED-H培養(yǎng)液中,10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿預(yù)包被0.1%明膠,至細(xì)胞密度約為80%～90%。每個10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿操作:124 μL的CaCl2與適量的水混合均勻,將已混勻的質(zhì)?；旌弦褐鸬渭尤?終體積為1 mL,吹打混勻;加入1 mL 2xHEPES液,混勻靜置20 min;將混合液均勻點加到細(xì)胞培養(yǎng)皿后,輕晃擴(kuò)散;6 h后,移除含有DNA磷酸鈣復(fù)合物的上清,代之以正常培養(yǎng)液DMED-H(10%FBS)并開始計時;轉(zhuǎn)染24 h后,補(bǔ)加5 mL培養(yǎng)液;48、72 h各收集一次病毒,將合并的病毒上清在高速超濾濃縮離心管中離心濃縮50倍,-80℃保存。

1.2.2 建立穩(wěn)定表達(dá)RFP的ES細(xì)胞系

對C57小鼠的ESCs采用N2B27+3i無血清培養(yǎng)體系[7],培養(yǎng)板用明膠預(yù)包。將病毒濃縮液點加入生長狀態(tài)良好的mESC,12 h后換液,隔天熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況,挑出紅色熒光的mESC單克隆化,96孔板擴(kuò)大培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)移到24、6孔板擴(kuò)大培養(yǎng),挑取熒光最強(qiáng)克隆二次篩選。

將獲得的DsRed-ESCs用天根公司的DNA提取試劑盒總DNA。用PCR對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行基因表型檢測。DsRed-Express引物為上游引物為:CTA GCTAG C TAG ATGG CCTCCTCCGA,下游引物為:TGG TGGACAAGGA CATC CTTAAG CGG。

1.2.3 胚胎干細(xì)胞在不同部位的成瘤

選擇生長狀態(tài)良好的DsRed-ESCs,制成高密度單細(xì)胞懸液(PBS),分別1×106個細(xì)胞注射到裸鼠的皮下,C57小鼠的皮下、腹腔和肝部(經(jīng)肝門靜脈注射)。4周后,處死小鼠,觀察成瘤情況,摘除畸胎瘤。將得到的畸胎瘤用4%PFA固定,送由東方肝膽外科醫(yī)院病理科進(jìn)行石蠟包埋,按照步驟對切片進(jìn)行H&E染色[8]。

1.2.4 RT-PCR及qPCR法檢測細(xì)胞組織中的基因表達(dá)

將各部位獲得的畸胎瘤切小塊研磨,應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總mRNA,細(xì)胞則直接棄去上清后加入Trizol提取。經(jīng)IMPLEN公司的微量核酸蛋白檢測儀測定濃度后,采用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20℃保存。cDNA樣品用ddH2O稀釋后進(jìn)行半定量RT-PCR,以檢測干細(xì)胞標(biāo)記Oct4、Sox2、Nanog、Esg1、Fgf4、Utf1的表達(dá)。每100 μL PCR-Mastermix種10×Taq Buffer 10 μL,dNTP (10mmol/L each) 4 μL,上下游引物(10 μmol/L) 5 μL,Taq DNA Polymerase (5 U/μL) 3 μL,各基因引物見表1,β-Actin為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA按1∶4稀釋,取1 μL作模板,加入到19 μL PCR-Mastermix,按 94℃ 1 min、核酸解鏈溫度-5℃ 45 s、72℃ 1 min循環(huán)25次,72℃終延伸10 min的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

Real-Time qPCR通過TOYOBO公司的SYBR? Realtime PCR Master Mix試劑盒,應(yīng)用ABI Step OneTM Real-Time PCR System檢測肝特異性基因AFP基因的表達(dá)水平,Gapdh為內(nèi)參,各基因的引物見表2。

表2 Real-Time qPCR引物

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的小鼠胚胎干細(xì)胞

含DsRed-Express的慢病毒三質(zhì)粒按比例經(jīng)磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24、48 h后在熒光顯微鏡下可見70%、90%的細(xì)胞發(fā)出紅色熒光(圖1),證明攜帶DsRed-Express的慢病毒已經(jīng)在細(xì)胞內(nèi)成功包裝,而且轉(zhuǎn)染效率較高。將病毒濃縮液轉(zhuǎn)染mESCs 24 h以后,可在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)紅光的克隆。挑選熒光強(qiáng)度較大的單細(xì)胞于96孔板中二次培養(yǎng),得到穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的小鼠胚胎干細(xì)胞系(Red-ESCs)(圖2(a))。PCR結(jié)果證明Red-ESCs攜帶約700 bp的DsRed基因(圖2(b))。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞情況

圖2 獲得穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的mESCs

2.2 Red-ESCs具有多能性

圖3為半定量RT-PCR檢測Red-ESCs部分多能性基因的結(jié)果,一些與干細(xì)胞多能性相關(guān)的基因如Oct4、Sox2、Nanog等的表達(dá)與未轉(zhuǎn)染的ESCs相比沒有明顯差別。將Red-ESCs細(xì)胞注射入裸鼠皮下,4周后可以形成約1 cm的腫瘤,圖4 H&E染色可見腫瘤含有三胚層的組織,證明Red-ESCs具有全能性。ESCs經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后能夠表達(dá)紅色熒光蛋白,轉(zhuǎn)染過程對它的多能性影響不大。

注:ESC:未經(jīng)病毒處理細(xì)胞,作為陽性對照;MEF:小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,作為陰性對照。

圖3 Red-ESCs多能性基因的表達(dá)結(jié)果

圖4 裸鼠內(nèi)形成畸胎瘤的H&E染色結(jié)果

2.3 Red-ESCs在體內(nèi)不同部位成瘤

將相同濃度的單細(xì)胞懸液注射到C57小鼠的皮下,腹腔和肝臟,4周后處死小鼠,均可在注射部位觀察到畸胎瘤的生成。這些畸胎瘤從外觀上沒有明顯的差異,但是圖5 RT-PCR的結(jié)果表明某些多能基因的表達(dá)受到了影響,如Fgf1,Utf1在皮下和腹腔的畸胎瘤組織中沒有表達(dá),但在肝臟畸胎瘤組織中表達(dá)量升高。因為肝部微環(huán)境比其他部位要復(fù)雜得多,所以我們另外檢測了AFP這個肝部特異性表達(dá)的基因。從圖6 qPCR的結(jié)果可以看出,肝部畸胎瘤的AFP的表達(dá)上是遠(yuǎn)高于其他部位的畸胎瘤。

圖5 不同部位畸胎瘤多能性基因的表達(dá)注:Red-ESC:陽性對照;MEF:陰性對照;ST:皮下畸胎瘤;PT:為腹腔畸胎瘤;LT:肝部畸胎瘤。

圖6 不同部位畸胎瘤細(xì)胞肝特異性基因的表達(dá)注:以ESC的AFP表達(dá)量為1,ST:皮下畸胎瘤,PT:腹腔畸胎瘤,LT:肝部畸胎瘤。

3 討 論

胚胎干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)和疾病模型研究擁有巨大潛力,自發(fā)現(xiàn)以來一直是科學(xué)界的研究熱點。在不影響ESCs的全能性的情況下,建立帶有明顯標(biāo)記的胚胎干細(xì)胞無疑是為ESCs的體外分化和體內(nèi)研究帶來極大的便利。紅色熒光蛋白表達(dá)穩(wěn)定,十分適合標(biāo)記細(xì)胞,在不少情況下可以起到與綠色熒光蛋白互補(bǔ)的作用。這項研究中,利用慢病毒將紅色熒光蛋白基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞,通過二次篩選得到穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的胚胎干細(xì)胞系(Red-ESC)。其后的多能基因檢測和裸鼠成瘤試驗均表明,插入的RFP基因并未對細(xì)胞的多能性造成極大的影響,Red-ESCs仍保有ESCs的部分全能性。

盡管在研究中發(fā)現(xiàn)體內(nèi)不同部位RED-ESCs都可以形成畸胎瘤,在腫瘤的外觀沒有明顯的差別,但是從RT-PCR的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),ESCs的多能性受到了部分影響。雖然Sox2和Nanog這2個干細(xì)胞維持多能性的重要調(diào)節(jié)基因的表達(dá)沒有明顯的減少,但是Fgf1、Utf1在皮下和腹腔畸胎瘤的表達(dá)明顯下降,Utf1的表達(dá)在肝臟畸胎瘤中卻呈上升狀態(tài)。成纖維細(xì)胞生長因子1(FGF1)受Fgf1編碼,是FGF蛋白家族一個重要的成員,參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、血管形成、組織修復(fù)等廣泛的細(xì)胞生理活動[9],Fgf1的表達(dá)改變對細(xì)胞的影響是十分深遠(yuǎn)的。Utf1基因在維持干細(xì)胞的自我更新起到重要的緩沖調(diào)節(jié)作用,可以通過與Myc和PRC2協(xié)同作用維持胚胎干細(xì)胞的全能性和長期增殖能力[10]。肝臟畸胎瘤中Utf1的表達(dá)明顯升高可能是胚胎干細(xì)胞受到肝臟微環(huán)境作用為維持自我更新能力的一個應(yīng)激反應(yīng)。

目前,干細(xì)胞的體外培養(yǎng)誘導(dǎo)是其進(jìn)入臨床應(yīng)用的主要途徑,科學(xué)家已經(jīng)采用擬胚體誘導(dǎo)、體細(xì)胞共培養(yǎng)、三維立體培養(yǎng)等多種方式成功的將人的胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、少淋巴細(xì)胞、胰島細(xì)胞等幾十余種細(xì)胞,并且這些細(xì)胞移植入體內(nèi)能夠模擬一定的生物功能[11-13]。胚胎干細(xì)胞之所以不能直接應(yīng)用于臨床的原因是其在體內(nèi)的分化不受控制,若直接注入體內(nèi)會形成畸胎瘤,引發(fā)免疫反應(yīng)[14]。畸胎瘤是一類自胚胎性組織的惡性瘤組織,其分離得到的細(xì)胞兼具腫瘤惡性和多能性,為胚胎癌細(xì)胞(EC)。由于胚胎癌干細(xì)胞特性與腫瘤干細(xì)胞特性有相近之處,有學(xué)者猜測腫瘤干細(xì)胞可能來自于正常干細(xì)胞的癌變,有少量存在于成體器官中的胚胎性組織,一般處于靜息狀態(tài),但是若所處微環(huán)境變化,這些殘存的胚胎組織會重新開始增殖,但由于相關(guān)的調(diào)控的缺失,只能產(chǎn)生大量類似胚胎組織的細(xì)胞而不能發(fā)育成完整的個體,形成腫瘤。因為胚胎組織的這種變化與體內(nèi)環(huán)境相關(guān),故本文通過將胚胎干細(xì)胞注射入皮下,腹腔和肝內(nèi),觀察體內(nèi)不同微環(huán)境對胚胎干細(xì)胞的影響。

肝臟是人體一個重要的器官,功能繁多,因此肝臟微環(huán)境比皮下或者腹腔要復(fù)雜許多,胚胎干細(xì)胞可能在這樣復(fù)雜的環(huán)境下獲得某些肝特性。我們用qPCR法檢測肝部畸胎瘤檢測的AFP表達(dá)。AFP是幼肝細(xì)胞特異性表達(dá)的基因[15],表明有部分細(xì)胞在肝部微環(huán)境的影響下向著肝細(xì)胞的方向分化。值得注意的是AFP同時也是肝癌細(xì)胞的一個標(biāo)記物[16],ESCs在肝臟微環(huán)境的影響下也存在著朝肝癌細(xì)胞方向惡化的可能性。

4 結(jié) 論

通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的小鼠胚胎干細(xì)胞系,并且標(biāo)記蛋白的表達(dá)對胚胎干細(xì)胞的全能性沒有明顯影響,將該細(xì)胞注射入體內(nèi)不同部位均可形成畸胎瘤。但是這些畸胎瘤細(xì)胞在某些多能性基因和組織特異性基因的表達(dá)存在著一定的差異,甚至有表達(dá)癌癥相關(guān)的標(biāo)記基因,說明體內(nèi)微環(huán)境對ESCs的影響是復(fù)雜多變的,在今后的胚胎干細(xì)胞研究中對體內(nèi)環(huán)境應(yīng)該更加重視。

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(責(zé)任編輯：許惠兒)

Establishment of Mouse Embryonic Stem Cell Line Marked by Red Fluorescent Protein and Primary Study on Its Tumor in Vivo

ZHAOWu-yang1,LIUTao2,QIANQi-jun1,2

(1.School of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China; 2.Laboratory of Viral and Gene Therapy,Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital,Shanghai 200438,China)

This paper establishes a mouse embryonic stem cell line which can express red fluorescent stably and studies its ability to form teratoma in different parts in vivo.DsRed-Express plasmid is constructed.Calcium phosphate method is used to pack it into lentiviral transfection mouse embryonic stem cells (mESCs).Strong positive clone is gained through screening.The cell characteristics are tested by RT-PCR test and tumor formation experiment in nude mice and C57 mice.Finally,Red-ESCs which can express red fluorescent stably are gained.Red-ESCs can express pluripotent genes,such asOct4,Sox2 andNanog,and form tumor in nude mice.Teratoma in different parts has differences in gene expression.Teratoma formed in liver expresses hepatic specific gene.Mouse embryonic stem cell line which can express red fluorescent stably is established successfully.Teratoma nature is influenced by internal environment.

embryonic stem cells; red fluorescence protein; teratoma; hepatic specific gene

1673-3851 (2015) 02-0244-05

2014-05-20

國家杰出青年科學(xué)基金項目(30925037)

趙無恙(1988-),女,浙江臨海人,碩士研究生,主要從事干細(xì)胞腫瘤學(xué)方面的研究。

錢其軍,E-mail:qianqj@163.com

Q256

A