陳周偉,朱麗敏,朱 聰,張思泉,符遙杰,沈建宇,郭江峰,丁先鋒

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018; 2.浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司,杭州 310012;3.杭州市西溪醫(yī)院,杭州 310023)

乙肝病毒編碼miRNA的預(yù)測(cè)及鑒定

陳周偉1,朱麗敏1,朱 聰2,張思泉3,符遙杰1,沈建宇1,郭江峰1,丁先鋒1

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018; 2.浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司,杭州 310012;3.杭州市西溪醫(yī)院,杭州 310023)

為探究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是否能夠編碼microRNA(miRNA),與宿主mRNA靶向結(jié)合來參與病毒感染的調(diào)控機(jī)制,實(shí)驗(yàn)通過Vir-Mir數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)乙肝病毒編碼的pre-miRNA,并結(jié)合miRNA測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證成熟體miRNA。結(jié)果顯示:乙肝病毒DNA陽性的肝癌血清樣本中存在六條pre-miRNA,并成功驗(yàn)證其中一條成熟體命名為hbv-miR-15467,為肝病治療提供新的思路。

乙型肝炎病毒; miRNA; 預(yù)測(cè)

0 引 言

MicroRNAs是近年來在多種真核細(xì)胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的,長(zhǎng)度約為22 nt的非編碼RNA。病毒miRNA產(chǎn)生過程類似于宿主細(xì)胞miRNA,成熟的miRNA大小和結(jié)構(gòu)也與其他生物的miRNA類似[1],miRNA在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ作用下進(jìn)行核內(nèi)轉(zhuǎn)錄,經(jīng)過加工形成初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-miRNA,隨后經(jīng)核糖核酸內(nèi)切酶Ⅲ(Drosha)剪切形成pre-miRNA,這些pre-miRNA依賴于運(yùn)輸?shù)鞍譋xponin-5從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì),由另一類核糖核酸內(nèi)切酶Ⅲ(Dicer)切除其莖環(huán)結(jié)構(gòu),最終形成了成熟的miRNA[2]。miRNA能作用于靶基因mRNA 3′-UTR區(qū),以干擾mRNA翻譯的方式來負(fù)向調(diào)控基因的表達(dá)。miRNAs作為基因分子領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA參與多種病毒性疾病,可通過影響病毒的復(fù)制、宿主免疫應(yīng)答來改變病毒復(fù)制能力[3]。Sam等[4]研究發(fā)現(xiàn)病毒也能編碼部分miRNA,目前已有超過250條病毒來源的miRNA得到證實(shí)[5],病毒miRNAs已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)。

乙肝病毒相關(guān)性疾病包括由乙肝病毒引起的病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化及肝細(xì)胞癌等,嚴(yán)重威脅著人類的健康。我國(guó)約有1.2億乙肝病毒攜帶者,約占我國(guó)總?cè)丝诘?.8%,慢性乙肝和肝硬化患者有3000萬之多,乙型肝炎發(fā)展為肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)非常高,每年因肝硬化和肝癌死亡人數(shù)也超過30萬[6]。HBV是一種部分環(huán)化的雙鏈DNA病毒,屬嗜肝DNA病毒科,基因組長(zhǎng)約3.2 kb[7]。病毒DNA的長(zhǎng)鏈為負(fù)鏈,較短鏈為正鏈,兩鏈DNA的5′端有長(zhǎng)達(dá)250～300個(gè)互補(bǔ)的堿基,通過堿基配對(duì)構(gòu)成環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)。HBV感染宿主后,宿主本身miRNA對(duì)病毒起作用,同時(shí)病毒編碼的miRNA也可以作用于宿主基因[8]。本實(shí)驗(yàn)通過預(yù)測(cè)HBV基因組編碼的miRNA分子,尋找到新的miRNA并預(yù)測(cè)其靶基因,探究HBV病毒與宿主之間miRNA的調(diào)控機(jī)制,以助于闡釋HBV相關(guān)肝病發(fā)生發(fā)展中的致病機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所使用的肝癌患者血清和健康人血清樣本均來自杭州西溪醫(yī)院,肝癌血清樣本來自20例未接受任何治療的肝癌患者,包括12例HBV DNA陽性患者和8例陰性患者,健康人血清樣本來自10例體檢志愿者。miRNeasy Serum/Plasma Kit購(gòu)自Qiagen公司,PCR引物由上海生工公司合成,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均購(gòu)自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒miRNA預(yù)測(cè)

利用Vir-Mir數(shù)據(jù)庫(kù)(http://alk.ibms.sinica.edu.tw/cgi-bin/miRNA/miRNA.cgi)預(yù)測(cè)HBV基因組編碼的pre-miRNA,通過Genebank檢索HBV全基因序列(序列號(hào)為NC_003977)。Vir-Mir數(shù)據(jù)庫(kù)提供預(yù)測(cè)的病毒miRNA的候選發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列設(shè)定參數(shù)條件為:GC含量38%～65%;核心最小自由能37.5～19.5;發(fā)夾結(jié)構(gòu)最小自由能50.9～28.2,得分在50分以上[9]。

1.2.2 樣本制備

收集5 mL全血置于血清收集管;溫和顛倒收集管5～8次;常溫下靜置30 min;然后將收集管置于離心機(jī),4 300 r/min,常溫離心10 min;將獲得的上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管;11 600 r/min,離心2 min;分離到的血清置于-80℃冰箱保存。按照miRNeasy Serum/Plasma Kit使用說明書,取200 μL血清提取總RNA,避免基因組DNA污染,洗脫得到50 μL的RNA溶液,置于-80℃冰箱備用。

1.2.3 候選pre-miRNA的初步驗(yàn)證

使用PCR方法對(duì)經(jīng)Vir-Mir數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的候選前體分子進(jìn)行初步驗(yàn)證,樣本為HBV DNA陽性的肝癌患者血清與健康人血清。使用軟件Primer Primier 5設(shè)計(jì)候選pre-miRNA的擴(kuò)增引物,提取樣本的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,通過PCR方法驗(yàn)證預(yù)測(cè)的前體分子是否存在。

1.2.4 成熟體miRNA的定位

利用二代測(cè)序方法對(duì)HBV DNA陽性肝癌患者的血清樣本進(jìn)行miRNA測(cè)序,測(cè)序結(jié)果得到的小分子片段與候選pre-miRNA序列進(jìn)行比對(duì),分析數(shù)據(jù),對(duì)成熟體miRNA定位。設(shè)計(jì)候選成熟體miRNA的特異擴(kuò)增引物,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR來驗(yàn)證其能否成為成熟體miRNA。

1.2.5 miRNA靶基因預(yù)測(cè)

首先使用RNAhybrid軟件(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)預(yù)測(cè)HBV編碼的miRNA作用于人類的潛在靶基因,設(shè)定參數(shù)條件為:螺旋限制在2～7個(gè)核苷酸;最小自由能比例在85%以上[10]。RNAhybrid是一種用于尋找一條長(zhǎng)鏈RNA和一條短鏈RNA的最小配對(duì)自由能的工具,例如預(yù)測(cè)一條短鏈序列結(jié)合到長(zhǎng)鏈的最佳位置上,適用于未命名的miRNA預(yù)測(cè)其靶基因位點(diǎn)。其次,通過MicroInspector軟件(http://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/)驗(yàn)證miRNA及其預(yù)測(cè)的靶基因是否存在結(jié)合可能性[11]。MicroInspector軟件允許用戶輸入miRNA序列或序列片段,從不同的數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇miRNA,同時(shí)也允許自定義miRNA和靶基因二聚體雜交溫度和自由能等參數(shù)[12],適用于未知序列的靶基因預(yù)測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 HBV編碼的miRNA前體分子的預(yù)測(cè)

將HBV基因序列號(hào)NC_003977輸入Vir-Mir數(shù)據(jù)庫(kù),HBV基因組中共預(yù)測(cè)到6條候選miRNA前體分子,其中正向序列中有4條(15464、15465、15466和15467),反向序列中有2條(15468、15469)(表1)。上述6條序列經(jīng)RNAstructure5.3軟件分析,得到二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1),顯示這6條候選序列均能形成典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu),這提示HBV可能編碼病毒來源的microRNA分子。

表1 HBV基因組中的候選miRNA前體分子

圖1 候選miRNA前體分子的發(fā)夾結(jié)構(gòu)

2.2 miRNA前體分子的初步驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證6條候選pre-miRNA是否存在于肝癌患者血清,設(shè)計(jì)pre-miRNA的PCR引物(表2),通過PCR擴(kuò)增目的片段。聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)HBV DNA陽性肝癌血清樣本中檢測(cè)到目的片段,健康人血清未檢測(cè)到(圖2)。為進(jìn)一步確定序列準(zhǔn)確性,將目的片段割膠回收,使用TA克隆法與pMD18-T Vector連接,篩選與鑒定重組質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)6條目的片段的Sanger測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)的候選前體序列基本匹配,存在1～4個(gè)堿基錯(cuò)配。這表明機(jī)體內(nèi)含有大量乙肝病毒,復(fù)制比較活躍,傳染性較強(qiáng)的HBV DNA陽性肝癌患者血清樣本中的確存在預(yù)測(cè)的候選miRNA前體分子,HBV編碼的miRNA與肝癌發(fā)生發(fā)展可能存在一定的聯(lián)系。

表2 候選miRNA前體分子的PCR引物序列

注:F:Forward primer;R:Reverse primer。

圖2 不同樣本6%聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

2.3 成熟miRNA的定位

通過二代測(cè)序方法對(duì)HBV DNA陽性的肝癌血清樣本進(jìn)行miRNA測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果得到的小分子片段與候選pre-miRNA序列進(jìn)行比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)有4條候選前體分子即15464—15467有比對(duì)結(jié)果,不同位置的候選成熟體有不同的reads數(shù),結(jié)果見圖3。筆者將選取reads數(shù)相對(duì)高,二級(jí)結(jié)構(gòu)具有形成成熟miRNA潛力的序列(圖3中截取部分),設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物,以肝癌血清總RNA為樣本,進(jìn)一步用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示僅15467:ugccuuggguggcuuuggggca成熟miRNA的擴(kuò)增曲線平滑且隨著循環(huán)數(shù)的增加,熒光信號(hào)具有明顯的對(duì)數(shù)擴(kuò)增期,而空白對(duì)照無連續(xù)曲線生成,并且溶解曲線出現(xiàn)明顯的單峰,說明擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性(圖4),因此驗(yàn)證了15467前體分子可剪切形成成熟miRNA,將該成熟體miRNA命名為hbv-miR-15467。

圖3 不同位置的候選成熟體所占read比例

圖4 hbv-miR-15467的擴(kuò)增曲線與溶解曲線

2.4 miRNA的靶基因預(yù)測(cè)

使用RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)成熟體miRNA的靶基因,hbv-miR-15467預(yù)測(cè)到3個(gè)靶基因,包括軟骨相關(guān)蛋白(CRTAP),細(xì)胞分裂周期相關(guān)因子1(FZR1)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFB1)(表3)。此外,本實(shí)驗(yàn)還使用MicroInspector軟件預(yù)測(cè)miRNA及其靶標(biāo)的結(jié)合情況,靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果和RNAhybrid類似。這表明CRTAP、FZR1及TGFB1基因具有一定的驗(yàn)證價(jià)值,可能有助于探究HBV病毒與宿主之間進(jìn)行的miRNA調(diào)控機(jī)制。

表3 成熟miRNA的靶標(biāo)預(yù)測(cè)

3 討 論

我國(guó)作為肝病大國(guó),導(dǎo)致肝癌高發(fā)生率的一部分原因是由于乙肝病毒感染,超過8%的肝癌患者都遭受病毒感染[13],因此探究乙肝病毒的致病機(jī)理至關(guān)重要?？共《局委煙o疑是阻止肝硬化進(jìn)程及肝癌發(fā)生的重要途徑,而目前的重組干擾素及核苷類似物等抗病毒治療手段療效不夠滿意[6]。HBV的復(fù)制及其致病的分子機(jī)制尚未完全闡明,本研究為病毒感染研究提供了新的思路。

MicroRNA作為普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一類內(nèi)源性基因表達(dá)調(diào)控因子,在各種生理病理過程中發(fā)揮的重要作用使其迅速成為生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。病毒編碼的miRNA的作用一般可分為三類:延長(zhǎng)感染細(xì)胞的壽命;逃避免疫反應(yīng);調(diào)節(jié)宿主或病毒基因[5]。病毒可利用自身編碼的miRNA與自身基因序列結(jié)合來逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)督和維持潛伏狀態(tài)[14]。例如,孢疹病毒[15-16](Epstein Barr virus,EBV),卡波氏孢疹病毒[17](KSHV)和馬立克氏病毒[18](MDV1)編碼的病毒miRNA能夠通過作用于宿主細(xì)胞的促凋亡因子來抑制細(xì)胞凋亡。由于病毒基因組較小且緊致,形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的背景片段數(shù)量很小,因此盡管基于序列和結(jié)構(gòu)特征打分的預(yù)測(cè)方法較為簡(jiǎn)單,但仍然在病毒miRNA預(yù)測(cè)中取得了較好的效果[19]。Vir-Mir是專門用于預(yù)測(cè)病毒編碼miRNA的數(shù)據(jù)庫(kù),并已成功預(yù)測(cè)出5種病毒的64條已知前體miRNA[9]。目前約有26%的已知病毒miRNAs類似于宿主miRNA通過種子序列結(jié)合靶基因發(fā)揮調(diào)控作用[5]。因此,使用RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)hbv-miR-15467的靶標(biāo),并使用MicroInspector軟件驗(yàn)證了miRNA及其潛在靶基因CRTAP、FZR1和TGFB1確實(shí)存在結(jié)合可能性。其中CRTAP為軟骨相關(guān)蛋白,主要與成骨不全相關(guān);FZR1為細(xì)胞分裂周期相關(guān)因子1,是細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞基,與胎盤發(fā)育相關(guān),目前無資料顯示CRTAP和FZR1與病毒感染或肝癌生成相關(guān);而TGFB1是一個(gè)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的重要因子,在組織再生、細(xì)胞分化,胚胎發(fā)育及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)中起重要作用[20]。本實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)的病毒miRNA及其靶基因的相互作用還需通過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,可能為抗乙肝病毒治療提供新的治療靶點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯：許惠兒)

Prediction and Identification of HBV-Encoded miRNA

CHENZhou-wei1,ZHULi-min1,ZHUCong2,ZHANGSi-quan3,FUYao-jie1,SHENJian-yu1,GUOJiang-feng1,DINGXian-feng1

(1.School of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China; 2.Zhejiang Tianke High-Tech Development Co.,Ltd.,Hangzhou 310012,China; 3.Hangzhou Xixi Hospital,Hangzhou 310023,China)

To explore whether the hepatitis B virus (HBV) can encod microRNA (miRNA) and involve in regulation of virus infection by targeting the host mRNA,Vir-Mir database was used to predict HBV-encoded pre-miRNA.The mature miRNA was validated by miRNA sequencing and real-time fluorescence quantitative PCR method.The results show that six pre-miRNAs exist in lover cancer serum sample with positive HBV DNA level.A mature miRNA named hbv-miR-15467 was validated successfully.This paper provides new thoughts for liver cancer treatment.

hepatitis B virus; miRNA; prediction

1673-3851 (2015) 02-0253-05

2014-05-21

浙江省公益技術(shù)研究社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(2012C23072)

陳周偉(1988-),女,浙江溫州人,碩士研究生,主要從事核酸方面的研究。

丁先鋒,E-mail:bdd114@163.com

Q52

A