郭曉強(qiáng)

石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系，石家莊 050081

酶的研究與生命科學(xué)(二)：氧化酶和ATP酶的研究

郭曉強(qiáng)?

石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程系，石家莊 050081

生物氧化是機(jī)體能量生成的基礎(chǔ)，是生命得以維持的基本保證。細(xì)胞色素氧化酶的發(fā)現(xiàn)開啟了現(xiàn)代生物氧化研究的序幕：一方面鑒定了大量氧化酶，從而充實(shí)了氧的利用特征；另一方面脫氫酶及輔助因子的鑒定進(jìn)一步理解了生物氧化的本質(zhì)為氫與氧結(jié)合生成水，同時釋放能量促使ATP生成的過程。ATP合酶和Na+，K+-ATP酶的發(fā)現(xiàn)推動了對ATP生成和利用機(jī)制的研究。許多酶的催化都需要ATP的輔助，如泛素連接酶等，相關(guān)研究拓展了對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的認(rèn)識。筆者通過生物氧化(亦稱生物能學(xué))發(fā)展過程的介紹而展現(xiàn)氧化酶和ATP酶的重要性。

生物氧化；氧化酶；脫氫酶；ATP合酶；ATP酶

新陳代謝既是生命典型特征之一，又是生命活動的基礎(chǔ)。新陳代謝主要包括物質(zhì)更新和能量代謝兩個過程，兩過程相輔相成共同維持了生命內(nèi)穩(wěn)態(tài)。能量生成的重要方式為生物氧化(biological oxidation)。生物氧化又名生物燃燒(biological combustion)或細(xì)胞呼吸(cell respiration)，是細(xì)胞內(nèi)通過特定氧化-還原反應(yīng)將大分子儲存的化學(xué)能轉(zhuǎn)換為生物能的過程。

18世紀(jì)，法國科學(xué)家拉瓦錫(Antoine Lavoisier)首先發(fā)現(xiàn)氧氣從而開啟了對氧化的全面研究。在隨后100多年內(nèi)，人們對氧化現(xiàn)象進(jìn)行了廣泛研究，從而對氧化機(jī)制有了較全面的理解，如氧化過程伴隨著電子轉(zhuǎn)移，需要較高能量啟動反應(yīng)，并且會有能量釋放(大部分劇烈氧化反應(yīng)釋放大量能量)。生物氧化與體外氧化存在一些差異，一方面其反應(yīng)調(diào)節(jié)溫和(需要催化劑協(xié)助)，另一方面能量需要逐步釋放(反應(yīng)物的間接接觸)等。20世紀(jì)初，生物氧化取得快速發(fā)展，知道糖(碳水化合物)通過氧化生成二氧化碳和水同時釋放能量，但兩個最基本問題需要解決：一是反應(yīng)如何進(jìn)行，二是能量如何釋放(進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為生物能)。許多科學(xué)家對此進(jìn)行了深入探索，首先在酶學(xué)上取得重大突破。

1 氧化酶的發(fā)現(xiàn)

瓦伯格(Otto Heinrich Warburg)是德國化學(xué)家，先后在弗賴堡大學(xué)和柏林大學(xué)完成有機(jī)化學(xué)學(xué)習(xí)，后又在海德堡大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位。1913年，瓦伯格加入愷撒威廉研究所(后來的馬普研究所)開始自己的科研生涯。早期主要研究癌細(xì)胞代謝，發(fā)現(xiàn)了著名的瓦伯格效應(yīng)(癌細(xì)胞內(nèi)糖酵解活性較高)，后轉(zhuǎn)向生物氧化研究。

無機(jī)化學(xué)已表明許多金屬具有啟動或加速氧化反應(yīng)的能力，因此瓦伯格推測生物氧化也需金屬或金屬化合物的參與。為了證明假說，瓦伯格需要檢測添加不同金屬(或金屬化合物)后細(xì)胞耗氧量和氧化速度間的關(guān)系，由于碳和氧反應(yīng)生成二氧化碳，因此單位時間內(nèi)二氧化碳的生產(chǎn)量可作為衡量氧化速度的重要指標(biāo)。但要完成該任務(wù)，瓦伯格面臨諸多難題。20世紀(jì)初用間接法測定二氧化碳含量，由于二氧化碳可溶于水，而所用儀器又比較陳舊，因此所得數(shù)據(jù)存在極大誤差，重復(fù)性差。瓦伯格憑借特有的勇氣和百折不撓的努力改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作，特別是1918年發(fā)明瓦伯格測壓計。該裝置設(shè)計精良，結(jié)構(gòu)簡單，測定二氧化碳時反應(yīng)靈敏，準(zhǔn)確性高，為隨后生物氧化特別是氧化酶類性質(zhì)和作用方式研究帶來便利。

早在第一次世界大戰(zhàn)前，瓦伯格就發(fā)現(xiàn)少量氰化物可抑制細(xì)胞內(nèi)生物氧化，后又應(yīng)用一氧化碳進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)，表明一氧化碳與氰化物類似，也抑制細(xì)胞呼吸。1921到1924年，瓦伯格和同事發(fā)現(xiàn)鐵的加入可使細(xì)胞氧化反應(yīng)速度加快，因此推測生物氧化至少需一種含鐵酶參與。已知氰化物可與鐵形成穩(wěn)定復(fù)合物而阻礙鐵生物功能的發(fā)揮，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氰化物和一氧化碳對體內(nèi)酶均具有抑制作用，隨后通過精密實(shí)驗(yàn)證實(shí)含鐵酶的存在[1]。瓦伯格在體外加熱血紅蛋白而獲得高鐵血紅素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與體內(nèi)含鐵氧化酶具有類似的催化性質(zhì)，隨后的多項(xiàng)證據(jù)顯示二者具有較多相似性。分光光度計檢測這兩類物質(zhì)單獨(dú)存在以及與一氧化碳結(jié)合后的光吸收情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸收光譜非常相似，從而證明了二者的一致性。1925年，凱林(David Keilin)分離出細(xì)胞色素a、b和c，并顯示細(xì)胞色素c在細(xì)胞呼吸中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。瓦伯格將含鐵酶與細(xì)胞色素進(jìn)行聯(lián)系，最終確定其就是細(xì)胞色素c氧化酶(圖1)[2]。

圖1 瓦伯格和細(xì)胞色素c

1931年，瓦伯格由于“呼吸酶本質(zhì)和作用方式的發(fā)現(xiàn)”而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，該項(xiàng)成就對推動生物氧化的研究發(fā)揮了重要作用。細(xì)胞色素c氧化酶是第一個鑒定的生物氧化酶，對推動隨后生物氧化研究的全面發(fā)展具有十分重要的意義。

2 脫氫在生物氧化中的作用

20世紀(jì)20年代，關(guān)于生物氧化機(jī)制，主要存在兩種假說：一是瓦伯格的氧激活假說，另一種是維蘭德(Heinrich Otto Wieland，1927年諾貝爾化學(xué)獎獲得者)的氫激活假說。維蘭德發(fā)現(xiàn)一些金屬可吸收氫，另外一些參與氧化的酶并不含有金屬，這類酶被稱為脫氫酶。維蘭德進(jìn)一步提出糖的生物氧化并非糖直接與氧反應(yīng)，而是先脫氫，氫再與氧反應(yīng)生成水同時釋放能量。這兩種假說表面上存在一定排斥性，但匈牙利生物化學(xué)家圣喬其(Albert von Szent-Gy?rgyi)卻將兩者實(shí)現(xiàn)了有機(jī)統(tǒng)一。

圣喬其在布達(dá)佩斯醫(yī)學(xué)院獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，隨后在德國多所大學(xué)進(jìn)行了生物化學(xué)的系統(tǒng)培訓(xùn)(瓦伯格和維蘭德均為德國人)，熟悉了生物氧化的相關(guān)基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)方法，此外還在劍橋熟悉了維生素研究的相關(guān)知識。1928年，圣喬其從柑橘類水果、一些蔬菜和腎上腺中分離得到一種還原性物質(zhì)，但不知具體成分，將其命名為己糖醛酸。1931年秋，圣喬其動物實(shí)驗(yàn)表明己糖醛酸也具有預(yù)防壞血病的作用，從而確定這種物質(zhì)就是維生素C(或抗壞血酸)[3]。

圣喬其決定體外人工構(gòu)建呼吸系統(tǒng)，將細(xì)胞色素氧化酶和食物以及脫氫酶混合，但是該系統(tǒng)無法應(yīng)用氧而實(shí)現(xiàn)生物氧化，這意味著該系統(tǒng)無法正常工作，缺失了某種必要成分。隨后他發(fā)現(xiàn)脫氫酶存在輔酶，而該輔酶含有核苷酸，證實(shí)為輔酶Ⅰ。瓦伯格進(jìn)一步確定輔酶Ⅰ中還含有一個嘌呤結(jié)構(gòu)，該物質(zhì)為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。圣喬其還發(fā)現(xiàn)另一種攜帶黃色的輔酶也發(fā)揮重要作用，瓦伯格將含有該染料的酶稱為黃素蛋白。他進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)該染料與維生素B2相關(guān)，為黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。然而體系內(nèi)補(bǔ)充了這兩類輔酶后，系統(tǒng)仍無法工作，意味著仍有未知成分需鑒定。

1933年，圣喬其與同事開始以鴿子胸部肌肉為材料研究生物氧化過程。由于鴿子胸肌進(jìn)行快速的生物氧化以產(chǎn)生能量供飛行之需，因此是理想的研究材料。當(dāng)時已知多種含有4個碳原子的二羧酸包括蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸等對生物氧化具有重要影響，推測認(rèn)為其參與了氧化過程。圣喬其等通過精密實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加少量二羧酸就可引起耗氧量顯著增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于化學(xué)反應(yīng)的需要量。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)二羧酸本身含量沒有明顯變化，這意味著它們發(fā)揮了催化劑的作用。根據(jù)一系列證據(jù)，圣喬其提出了自己的生物氧化模式，他認(rèn)為糖類首先將氫給予草酰乙酸，后者在蘋果酸脫氫酶催化下生成蘋果酸，蘋果酸將氫傳遞給延胡索酸，延胡索酸在琥珀酸脫氫酶催化下將氫交予琥珀酸，琥珀酸再將氫給予細(xì)胞色素，最終通過細(xì)胞色素c氧化酶與氧結(jié)合生成水(圖2)。在圣喬其生物氧化體系中，代謝物、二羧酸、脫氫酶輔酶(輔酶Ⅰ和黃素)、細(xì)胞色素氧化酶實(shí)現(xiàn)了有機(jī)結(jié)合， 更重要的是將新鑒定的維生素(維生素B2和維生素PP)也有機(jī)整合到生物氧化體系，形成了含有鐵的氧化酶和含有維生素的脫氫酶兩類酶(整合了氧激活和氫激活學(xué)說)，最終實(shí)現(xiàn)代謝物中氫與氧結(jié)合生成水，同時釋放能量。

圖2 圣喬其和脫氫作用

1937年，圣喬其由于“生物氧化過程特別是維生素C和延胡索酸催化作用的發(fā)現(xiàn)”而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。圣喬其的研究深化了對生物氧化過程的理解和認(rèn)識，但不久就發(fā)現(xiàn)，其細(xì)節(jié)上存在一定的不足。德裔英國生物化學(xué)家克雷布斯(Sir Hans Adolf Krebs)對其進(jìn)行了完善，提出了著名的三羧酸循環(huán)，展現(xiàn)了生物氧化全貌。

3 三羧酸循環(huán)的發(fā)現(xiàn)

克雷布斯在漢堡大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)學(xué)位，隨后在柏林開始了化學(xué)學(xué)習(xí)。1926年，克雷布斯成為愷撒威廉研究所瓦伯格的助手，并在隨后幾年中熟悉掌握了生物氧化的相關(guān)知識和實(shí)驗(yàn)操作。1933年，克雷布斯離開德國加入劍橋大學(xué)生物化學(xué)系，兩年后又成為謝菲爾德大學(xué)藥理系講師，開始全面研究生物氧化過程。

1937年，諾普(Franz Knoop)和同事發(fā)現(xiàn)檸檬酸也具有催化生物氧化的作用，并證明檸檬酸可首先被順烏頭酸酶催化生成異檸檬酸，異檸檬酸進(jìn)一步氧化脫氫生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸可進(jìn)一步氧化生成琥珀酸?？死撞妓购屯聞t發(fā)現(xiàn)檸檬酸一方面可生成α-酮戊二酸，另一方面還可以通過添加草酰乙酸再生。關(guān)于檸檬酸的再生機(jī)制，克雷布斯推測可能是草酰乙酸與丙酮酸或乙酸反應(yīng)生成。由于草酰乙酸又可以由琥珀酸代謝生成，因此這個代謝途徑明顯形成一個環(huán)狀系統(tǒng)。由于起始于檸檬酸，而檸檬酸含有三個羧基，因此稱為三羧酸循環(huán)(圖3)[4]。為了進(jìn)一步證實(shí)該假說，克雷布斯往系統(tǒng)添加蘋果酸脫氫酶抑制劑丙二酸，結(jié)果造成蘋果酸積累，同時引起其他代謝反應(yīng)終止。

1948年，克雷布斯又為三羧酸循環(huán)添加草酰琥珀酸、乙酰輔酶A和蘋果酸單酰輔酶A成分，從而形成最終的完善代謝過程。三羧酸循環(huán)最初是在糖代謝研究過程中發(fā)現(xiàn)，但進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其他物質(zhì)如脂肪和氨基酸等的徹底氧化也通過三羧酸循環(huán)，從而確立三羧酸循環(huán)是營養(yǎng)物質(zhì)氧化(此外還保護(hù)合成代謝)的共同通路。

圖3 克雷布斯和三羧酸循環(huán)

1953年，克雷布斯由于“三羧酸循環(huán)的發(fā)現(xiàn)”而與李普曼(Fritz Albert Lipmann)分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

4 輔酶A的發(fā)現(xiàn)

克雷布斯三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵是草酰乙酸生成檸檬酸的過程(只有該反應(yīng)完成才能成環(huán))，最早推測是丙酮酸或乙酸參與，但后來這種想法存在一定偏差，直到德裔美國科學(xué)家李普曼發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A才使該問題得到了完美解決。

李普曼1924年從柏林大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)學(xué)位，在學(xué)習(xí)過程中對生物化學(xué)產(chǎn)生了濃厚興趣。因此1926年，他加入愷撒威廉研究所成為邁爾霍夫(Otto Meyerhof，1922年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)的助手，于1927年獲得博士學(xué)位并開始研究肌肉中生化反應(yīng)的過程。

20世紀(jì)30年代，李普曼主要研究成纖維細(xì)胞中代謝，重點(diǎn)在于巴斯德效應(yīng)(氧的存在可抑制糖酵解)。由于糖酵解和有氧氧化的分支點(diǎn)在丙酮酸代謝，無氧情況下生成乳酸，但有氧情況下的產(chǎn)物及代謝過程尚不清晰。李普曼研究發(fā)現(xiàn)丙酮酸氧化過程中依賴無機(jī)磷酸的存在，并有ATP生成，因此推測乙酰磷酸是丙酮酸氧化的初產(chǎn)物。

1939年，李普曼來到美國，繼續(xù)研究乙酰磷酸在代謝中的作用。1941年，李普曼對攜帶細(xì)胞內(nèi)化學(xué)能的乙酰磷酸分析發(fā)現(xiàn)，其不僅含有富含能量的乙?；疫€含有富含能量的磷酸基，對此李普曼認(rèn)為乙酰基主要作為代謝過程中的乙?；d體，而三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)才是體內(nèi)能量代謝的“貨幣”。代謝物氧化生成的能量以ATP的形式貯存，而細(xì)胞內(nèi)各種代謝耗能則依賴于ATP水解釋放。

李普曼進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，乙酰磷酸在進(jìn)行乙?；揎椷^程中活性不足，因此可能有其他新因子發(fā)揮作用。隨后在鴿胸肌提取液中鑒定出一種熱穩(wěn)定因子，該因子廣泛存在于多種器官煮沸過的提取液中，而且利用透析法去除后補(bǔ)充任何已知的輔酶都無法恢復(fù)乙?；揎椈钚?，因此推測是一種新的輔酶。1946年，李普曼從豬肝中純化了該因子，并將其命名為輔酶A，A代表乙酸激活(activation of acetate)[5]。1953年，李普曼等進(jìn)一步?jīng)Q定輔酶A的化學(xué)組成，包含腺嘌呤、磷酸、泛酸和巰基等(圖4)，輔酶A是多種?；罨o酶。

圖4 李普曼和輔酶A

1953年，李普曼由于“輔酶A及其在代謝中重要作用的發(fā)現(xiàn)”而與克雷布斯分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

圣喬其的早期研究和三羧酸循環(huán)的提出與完善提供了營養(yǎng)物質(zhì)代謝過程中脫氫的基本過程，為生物氧化研究提供了清晰畫面。

5 多種氧化酶的發(fā)現(xiàn)

代謝途徑取得了一系列重大突破，氧化酶研究同時也取得許多重要進(jìn)展，其中瓦伯格和他的學(xué)生特奧雷爾(Axel Hugo Theodor Theorell)做出了最為重要的貢獻(xiàn)。

特奧雷爾是瑞典生物化學(xué)家，曾在卡羅林斯卡研究所獲得醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位。由于疾病原因他放棄醫(yī)學(xué)而轉(zhuǎn)向基礎(chǔ)研究。特奧雷爾早期重點(diǎn)研究血脂化學(xué)和血脂對紅細(xì)胞的效應(yīng)，開發(fā)了血漿清蛋白和球蛋白的分離技術(shù)。1933年，特奧雷爾來到德國柏林愷撒威廉研究所跟隨瓦伯格進(jìn)行酶學(xué)研究，從而奠定了成功的基礎(chǔ)。

1932年，瓦伯格和助手在酵母中發(fā)現(xiàn)一種黃酶并實(shí)現(xiàn)部分提純。該酶在還原狀態(tài)下無色，而氧化后變成黃色。同時，他們還確定該酶有兩部分組成：黃色色素和載體。黃色色素為核黃素，但游離核黃素?zé)o活性，與載體結(jié)合則有活性，對此現(xiàn)象無法給出合理解釋。特奧雷爾憑借自己在蛋白質(zhì)純化工作方面的基礎(chǔ)和精美設(shè)計，首先將該酶實(shí)現(xiàn)了高度純化，并使用自己在瑞典研究時已經(jīng)掌握的電泳技術(shù)證明確實(shí)不含有雜質(zhì)。更為重要的是，他還將該酶實(shí)現(xiàn)了結(jié)晶(這項(xiàng)成就在當(dāng)時較為難得)。特奧雷爾將這兩種物質(zhì)在低溫下處理后還可以分離得到黃色色素和無色蛋白質(zhì)。兩者單獨(dú)存在均無活性，而將兩者混合后重新恢復(fù)活性。這是首次完成的酶的拆分和再結(jié)合實(shí)驗(yàn)，隨后又確定黃色色素是黃素單核苷酸(Flavin mononucleotide, FMN)(圖5)，從而得出現(xiàn)代意義上酶蛋白和輔酶概念[6]。特奧雷爾還對黃酶中蛋白質(zhì)部分進(jìn)行深入研究，確定了黃酶在細(xì)胞氧化和呼吸鏈電子傳遞過程中的作用，極大地推動了生物氧化的研究。

圖5 特奧雷爾與氧化輔酶

1937年，特奧雷爾回到斯德哥爾摩，成為卡羅林斯卡研究所生物化學(xué)系主任，繼續(xù)進(jìn)行氧化酶方面的研究。1938年，特奧雷爾發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素c氧化酶中的血紅素與酶蛋白通過特殊方式結(jié)合，并于第二年成功純化細(xì)胞色素c。1941年，特奧雷爾與同事進(jìn)一步確定細(xì)胞色素c的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)以及其中鐵與蛋白質(zhì)的連接方式。1955年，特奧雷爾發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素c氧化酶核心含一個鐵原子和一個卟啉環(huán)，而這個核心被一個螺旋狀肽鏈圍繞，這個發(fā)現(xiàn)對理解細(xì)胞色素c氧化酶介導(dǎo)電子傳遞機(jī)制具有重要意義。特奧雷爾和同事還研究了細(xì)胞色素c氧化酶的酶促反應(yīng)速度和影響因素，這些研究不僅奠定了現(xiàn)代酶學(xué)基礎(chǔ)，而且還成為酶學(xué)研究的基本模式。

1941年，特奧雷爾和同事第一次分離并結(jié)晶了辣根過氧化物酶，1943年，又從牛奶中分離得到乳酸過氧化物酶，而最為重要的一項(xiàng)成就是還發(fā)現(xiàn)乙醇脫氫酶。乙醇脫氫酶是一種在肝臟和酵母中特異性表達(dá)的氧化酶。1948年，特奧雷爾研究所首先從肝臟中分離該酶并實(shí)現(xiàn)了結(jié)晶。在隨后幾年中對它進(jìn)行了廣泛研究，從而闡明了其催化反應(yīng)和特點(diǎn)。肝臟的乙醇脫氫酶將乙醇氧化為乙醛，而酵母乙醇脫氫酶可還原乙醛為乙醇。特奧雷爾與賓夕法尼亞大學(xué)查恩斯(Britton Chance)合作闡明乙醇氧化的代謝步驟，并提出著名的特奧雷爾-查恩斯機(jī)制。乙醇脫氫酶在隨后一段時間被應(yīng)用于法醫(yī)中乙醇的鑒定。

1955年，特奧雷爾由于在“氧化酶本質(zhì)和作用方式方面的發(fā)現(xiàn)”而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。由于生物氧化是物質(zhì)代謝基礎(chǔ)，而氧化酶又是生物氧化基礎(chǔ)，因此特奧雷爾的研究豐富了人們對氧化過程分子機(jī)制的理解，拓展了細(xì)胞氧化的研究和應(yīng)用。

6 ATP合酶作用機(jī)制的闡明

一系列進(jìn)展初步闡明生物氧化本質(zhì)是營養(yǎng)物質(zhì)包括糖、脂以及氨基酸通過脫氫沿呼吸鏈傳遞給氧，最終生成水，同時產(chǎn)生大量ATP?，F(xiàn)在面臨的一個重大問題是在生成水過程中ATP的生成機(jī)制。經(jīng)過幾十年研究科學(xué)家發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ATP是由細(xì)胞內(nèi)的線粒體或葉綠體分別通過細(xì)胞呼吸或光合作用產(chǎn)生，而對動物細(xì)胞而言，則基本上利用細(xì)胞呼吸(生物氧化)完成。當(dāng)時已經(jīng)知道ATP是由ADP加磷酸而成，該過程稱為磷酸化，而生物氧化過程中生成ATP的磷酸化稱為氧化磷酸化。20世紀(jì)50年代，關(guān)于氧化磷酸化的機(jī)制尚不清晰，最終科學(xué)家認(rèn)為和糖酵解過程中ATP的生成類似，存在一個高能中間產(chǎn)物，但遲遲未鑒定成功。突破來自于1960年奧地利科學(xué)家蘭克爾(Efraim Racker)首先純化出第一個氧化磷酸化酶F1(Factor 1)。該酶為一種可溶性物質(zhì)，主要定位于線粒體基質(zhì)。1963年，他們又進(jìn)一步純化出不溶性成分Fo(這里“o”代表寡霉素oligomycin)，其錨定在線粒體內(nèi)膜。F1、Fo統(tǒng)稱ATP合成酶，主要催化氧化過程中ATP的生成，但其如何參與生物氧化、如何偶聯(lián)不得而知。

1961年，英國科學(xué)家米切爾(Peter Mitchell)提出化學(xué)滲透假說解釋該問題?；瘜W(xué)滲透假說認(rèn)為：線粒體內(nèi)膜將線粒體區(qū)分為膜間隙和基質(zhì)兩部分，H+和電子傳遞過程中，H+被泵到線粒體膜間隙，而電子和O結(jié)合生成O2-，從而形成線粒體內(nèi)膜H+濃度梯度和電化學(xué)梯度，當(dāng)H+跨梯度內(nèi)流到線粒體基質(zhì)與O2-結(jié)合生成水，這種內(nèi)流驅(qū)動力促使ATP的生成。憑借這項(xiàng)貢獻(xiàn)米切爾獲得1978年諾貝爾化學(xué)獎，但H+跨膜驅(qū)動力推動ATP生成的詳細(xì)機(jī)制仍未解決。美國生物化學(xué)家博耶(Paul Delos Boyer)對此給出答案。

博耶在布賴厄姆?揚(yáng)大學(xué)(Brigham Young University, BYU)完成化學(xué)學(xué)業(yè)，隨后于威斯康星大學(xué)獲得生物化學(xué)碩士和博士學(xué)位，后進(jìn)入明尼蘇達(dá)大學(xué)開始酶學(xué)研究。在明尼蘇達(dá)大學(xué)，博耶應(yīng)用動力學(xué)、同位素和化學(xué)方法研究酶的作用機(jī)制。早期，博耶研究小組主要研究代謝酶，隨著ATP合酶的發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室方向發(fā)生了重大改變。

1964年，博耶首先提出ATP合成的關(guān)鍵源于酶的結(jié)構(gòu)變化。1973年，博耶提出ATP生成的第一個假說——結(jié)合變構(gòu)機(jī)制，認(rèn)為H+梯度跨膜產(chǎn)生的能量不是直接用于ATP生成，而是促進(jìn)已形成的ATP釋放。同事的肌球蛋白ATP合酶活性研究強(qiáng)化了博耶的自信。20世紀(jì)70年代中期，博耶進(jìn)一步推測ATP生成的第二個概念——催化協(xié)同假說。博耶認(rèn)為，ATP合酶的三個催化位點(diǎn)在工作過程中具有協(xié)同性，當(dāng)ADP與磷酸尚未生成ATP時，則另一位點(diǎn)結(jié)合的ATP無法釋放和利用。70年代末，博耶進(jìn)一步修正ATP生成機(jī)制，提出旋轉(zhuǎn)催化假說[7]。該假說認(rèn)為，ATP合酶F1部分含三個催化位點(diǎn)，它們可依次與ADP和磷酸結(jié)合，通過發(fā)生構(gòu)象改變生成ATP，隨后這些位點(diǎn)再次改變構(gòu)象而釋放ATP(圖6)。這些構(gòu)象改變是由酶Fo部分旋轉(zhuǎn)驅(qū)動催化完成，而旋轉(zhuǎn)動力來自H+跨線粒體內(nèi)膜運(yùn)動。

博耶為了使科學(xué)家接受假說，用一系列實(shí)驗(yàn)來提供證據(jù)。當(dāng)時已知ATP合酶F1部分含三個α亞基和三個β亞基，此外還含有一個γ亞基、δ亞基和ε亞基，其中催化位點(diǎn)位于β亞基(每個亞基含一個催化位點(diǎn))?？茖W(xué)家認(rèn)為，三個β亞基從統(tǒng)計學(xué)上說是不可能和其他單一亞基均等相互作用，因此也不可能包含三個完全相同的催化位點(diǎn)(博耶所有假說核心是三個催化位點(diǎn)完全一致)。博耶使用同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)三個催化位點(diǎn)性質(zhì)完全一致，沒有區(qū)別，而使用葉綠體和線粒體ATP合酶實(shí)驗(yàn)也顯示所有催化位點(diǎn)在行為上都高度一致。為了更好地解釋這種現(xiàn)象，博耶推測大的催化亞基(F1部分)圍繞一個小的不對稱核心旋轉(zhuǎn)運(yùn)動。20世紀(jì)90年代，博耶的假說開始得到科學(xué)界重視，而真正使大家接受旋轉(zhuǎn)催化機(jī)制是由于1994年英國科學(xué)家沃克(John Ernest Walker)獲得高分辨率牛心線粒體F1-ATP合酶。

圖6 博耶、沃克與ATP合酶

沃克在牛津大學(xué)圣凱瑟琳學(xué)院獲得學(xué)士學(xué)位并于1969年從牛津大學(xué)獲得博士學(xué)位，同時對蓬勃發(fā)展的分子生物學(xué)逐漸產(chǎn)生了濃厚興趣。1974年，沃克加入劍橋大學(xué)醫(yī)學(xué)研究委員會(MRC)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(這里是分子生物學(xué)的研究圣地，許多科學(xué)大師如克里克就在這里工作，曾誕生10多位諾貝爾獎獲得者)，并被分派到蛋白和核酸化學(xué)實(shí)驗(yàn)小組。首先，沃克分析了許多蛋白質(zhì)的序列，隨后發(fā)現(xiàn)了線粒體修改遺傳密碼的細(xì)節(jié)。1978年，沃克決定將蛋白質(zhì)化學(xué)方法應(yīng)用于膜蛋白，而ATP合酶成為他研究的主要目標(biāo)。

20世紀(jì)80年代，沃克確定了ATP合酶幾種亞基的氨基酸序列，還初步確定了亞基的不對稱分布特征，但詳細(xì)理解酶的作用機(jī)制就需在結(jié)構(gòu)上實(shí)現(xiàn)突破，而膜蛋白結(jié)晶是一個重大挑戰(zhàn)。1994年，沃克研究組利用晶體學(xué)方法獲得分辨率極高的牛心線粒體F1-ATP酶的晶體結(jié)構(gòu)[8]，從而為證實(shí)博耶的結(jié)合變化和旋轉(zhuǎn)催化機(jī)制起到關(guān)鍵性作用。利用X射線衍射分析顯示ATP合酶是一個橘子樣的扁圓球體，高8 nm，寬10 nm，其中的α、β亞基像橘子瓣一樣交替圍繞在γ亞基周圍(圖6)。精細(xì)晶體結(jié)構(gòu)讓我們清楚地觀察到此酶的三個催化亞基由于結(jié)合不同的核苷酸底物構(gòu)象明顯不同，有力支持博耶提出的結(jié)合變化機(jī)制，證明在催化循環(huán)的任一時刻三個催化亞基處于不同構(gòu)象，不同構(gòu)象之間轉(zhuǎn)化可能與γ亞基繞α3β3轉(zhuǎn)動運(yùn)動相關(guān)，為人們揭開迷霧起到了關(guān)鍵作用。

經(jīng)過20多年努力，博耶早期提出的假說終于得到證實(shí)：當(dāng)質(zhì)子跨膜運(yùn)輸時，帶動ATP合酶的類車輪結(jié)構(gòu)和連接桿轉(zhuǎn)動，就像流動的水帶動水輪機(jī)轉(zhuǎn)動一樣，引起其他部分轉(zhuǎn)動，在這種轉(zhuǎn)動下，ATP合成酶上三個催化部位構(gòu)象以抓住底物ADP和Pi合成ATP，并將其釋放，形象地刻畫出ATP合成酶的催化循環(huán)就像轉(zhuǎn)動的水輪機(jī)。

1997年，博耶和沃克由于“闡明了ATP合成的酶學(xué)機(jī)制”而分享諾貝爾化學(xué)獎的一半。

7 Na+, K+-ATP酶的鑒定和研究

一個細(xì)胞正常生存依賴于內(nèi)外環(huán)境的平衡，而這種平衡通過細(xì)胞膜上特定物質(zhì)協(xié)助完成。20世紀(jì)初，科學(xué)家就已知道非常精妙的Na+和K+平衡：細(xì)胞內(nèi)Na+保持較低濃度，而胞外濃度卻很高；相反，胞內(nèi)K+濃度很高，但胞外濃度卻很低。這種平衡并非靜態(tài)平衡。20世紀(jì)50年代，科學(xué)家霍奇金和同事發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞受刺激后，Na+會進(jìn)入細(xì)胞，刺激消失后細(xì)胞將胞內(nèi)額外Na+運(yùn)輸?shù)桨?，從而恢?fù)初始狀態(tài)。對于這種狀況的維持機(jī)制科學(xué)家一直缺乏詳細(xì)理解。科學(xué)家還注意到當(dāng)細(xì)胞ATP生成受到抑制則減少Na+運(yùn)輸，因此推測該過程尚需ATP參與。丹麥生物化學(xué)家斯科(Jens Christian Skou)Na+, K+-ATP酶的發(fā)現(xiàn)證明了這種推測。

20世紀(jì)50年代，斯科開始研究ATP的作用。斯科選擇蟹的神經(jīng)細(xì)胞膜進(jìn)行研究，這是因?yàn)楫?dāng)時神經(jīng)生物學(xué)研究已證明，神經(jīng)細(xì)胞Na+運(yùn)輸比較活躍。斯科最初推測神經(jīng)細(xì)胞膜上存在一種酶，該酶一方面可降解ATP，另一方面將Na+從胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨狻?/p>

斯科確實(shí)發(fā)現(xiàn)一種可降解ATP的酶，并且需要Mg離子參與。在實(shí)驗(yàn)中，斯科發(fā)現(xiàn)添加Na+可激活該酶，但達(dá)到的激活效應(yīng)非常有限，只有同時加入少量K+，該酶的活性才大大加強(qiáng)。事實(shí)上，斯科發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)添加的Na+和K+的濃度與正常狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞的這兩種離子濃度相等的情況下，該酶的活性才可以達(dá)到最大值。

1957年，斯科發(fā)表了第一篇關(guān)于ATP酶的論文[9]，并隨后在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，對這種重要酶有了更全面的理解。Na+, K+-ATP酶定位于細(xì)胞膜，有兩種亞基α和β構(gòu)成(后又發(fā)現(xiàn)還包括γ亞基)，α亞基執(zhí)行Na+-K+交換功能，β亞基負(fù)責(zé)穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)。一個ATP酶可在細(xì)胞內(nèi)與1分子ATP和3個Na+結(jié)合，ATP水解生成的ADP釋放而產(chǎn)生的磷酸與酶特定氨基酸結(jié)合，這造成酶的構(gòu)象改變，將結(jié)合的Na+釋放到胞外。在原來3個Na+位置上結(jié)合2個K+，此時酶結(jié)合的磷酸釋放，結(jié)構(gòu)再次發(fā)生改變，將K+帶入到細(xì)胞內(nèi)，完成離子交換(圖7)。隨后ATP酶可再結(jié)合1分子ATP和3個Na+，開始新一次的離子運(yùn)輸。

圖7 斯科和Na+, K+- ATP酶

1997年，斯科由于“發(fā)現(xiàn)第一個離子運(yùn)輸酶——Na+, K+-ATP酶”而獲得諾貝爾化學(xué)獎的另一半。Na+, K+-ATP酶消耗大量ATP，占每天ATP生成總量的1/3，該酶的正常功能是保持細(xì)胞內(nèi)K+和細(xì)胞外Na+的平衡，保證神經(jīng)元對外界刺激做出反應(yīng)并傳遞。Na+, K+-ATP酶還有其他重要功能，如Na+/K+平衡有利于細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)攝入和代謝廢物排出，營養(yǎng)或氧缺乏破壞ATP生成而使Na+, K+-ATP酶停止工作將導(dǎo)致細(xì)胞膨脹死亡。大腦中該狀況發(fā)生將造成快速出現(xiàn)意識不清和休克。自斯科發(fā)現(xiàn)Na+, K+-ATP酶以來，科學(xué)家又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他類型ATP酶，如H+, K+-ATP酶(參與胃酸生成)、Ca2+-ATP酶(控制肌細(xì)胞收縮)等。

8 泛素連接酶的發(fā)現(xiàn)和功能闡明

蛋白質(zhì)是一種非常重要的生命大分子，在許多生命活動如物質(zhì)代謝、血液凝固和細(xì)胞信息傳遞等過程中都發(fā)揮重要作用。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量動態(tài)平衡對于許多生理過程的順利完成都具有至關(guān)重要的意義。20世紀(jì)70年代，科學(xué)家已經(jīng)知道細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成主要依賴mRNA翻譯，而降解則通過兩條通路：一個為溶酶體降解通路，對蛋白質(zhì)無特異性，不消耗ATP；另一途徑需要消耗ATP，但機(jī)制不詳。

以色列科學(xué)家阿龍?切哈諾沃(Aaron Ciechanover)1971年從希伯來大學(xué)獲得理學(xué)學(xué)士學(xué)位，盡管3年后獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，但因大學(xué)期間對生物化學(xué)產(chǎn)生濃厚興趣，畢業(yè)后加入以色列理工學(xué)院赫什科(Avram Hershko)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行科學(xué)研究。赫什科是匈牙利裔以色列人。他于1969年從希伯來大學(xué)獲得博士學(xué)位，并在美國舊金山加州大學(xué)進(jìn)行2年博士后訓(xùn)練，1972年成為以色列理工學(xué)院一名員工。

赫什科主要研究細(xì)胞內(nèi)ATP依賴的蛋白質(zhì)降解。他和切哈諾沃以網(wǎng)狀紅細(xì)胞提取物為材料，在除去血紅蛋白的過程中發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞蛋白酶包含兩部分，其中第一部分為小分子熱穩(wěn)定性蛋白。小分子熱穩(wěn)定性蛋白于1980年證明是泛素(ubiquitin)，是一種廣泛存在于組織和器官且擁有76個氨基酸的小肽。赫什科和切哈諾沃為了更好地研究蛋白質(zhì)降解，一起來到美國福克斯蔡斯癌癥中心與羅斯(Irwin Rose)尋求合作。

圖8 切哈諾沃、赫什科和羅斯與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解

羅斯從芝加哥大學(xué)獲得生物化學(xué)學(xué)位，并于1952年獲得博士學(xué)位，1955年開始就一直研究蛋白質(zhì)降解。三人合作研究紅細(xì)胞蛋白酶的第二部分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這部分可進(jìn)一步分為ATP穩(wěn)定蛋白(分子量450 kD，后證明為蛋白酶體)和酶復(fù)合物[10]。1980年，他們進(jìn)一步確定泛素可被共價結(jié)合到蛋白質(zhì)而啟動蛋白降解，這次突破使科學(xué)界開始考慮泛素結(jié)合到目的蛋白的機(jī)制。

1981年到1983年間，三位科學(xué)家和助手鑒定了催化泛素降解的E1、E2和E3，并闡明了它們的功能。E1為泛素激活酶，可在ATP水解供能的前提下與泛素結(jié)合；E2為泛素結(jié)合酶，可被催化與泛素結(jié)合；而E3為泛素連接酶，可催化E2上連接的泛素與靶蛋白結(jié)合(圖8)。E3種類最為豐富，它決定靶蛋白泛素修飾的特異性[11]。后來科學(xué)家鑒定出蛋白酶體，可識別泛素化蛋白質(zhì)，從而啟動蛋白質(zhì)降解過程。

2004年切哈諾沃、赫什科和羅斯“由于泛素介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的發(fā)現(xiàn)”而分享諾貝爾化學(xué)獎。泛素介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的發(fā)現(xiàn)使我們在分子水平上理解細(xì)胞通過調(diào)節(jié)特定蛋白含量而保證許多生理過程如細(xì)胞分裂、DNA修復(fù)、新生蛋白質(zhì)“質(zhì)量”控制、免疫防御等的正確進(jìn)行。蛋白質(zhì)降解異?？稍斐啥喾N疾病發(fā)生，如癌癥和囊性纖維化變性等，因此三位科學(xué)家的發(fā)現(xiàn)亦為疾病治療提供了新方向。

能量是生命一切活動的基礎(chǔ)。缺乏能量，DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成無法完成；缺乏能量，觸覺感知、神經(jīng)信號、激素分泌和肌肉收縮等也無法完成。因此可以說，沒有能量就沒有生命。氧化酶和脫氫酶協(xié)同作用完成代謝物脫氫，氫和電子傳遞而產(chǎn)生氫離子梯度和氧離子，當(dāng)氫離子跨梯度運(yùn)輸進(jìn)入線粒體基質(zhì)與氧離子結(jié)合生成水時驅(qū)動ATP合酶轉(zhuǎn)動而釋放ATP，生成的ATP可供Na+, K+-ATP酶、蛋白激酶、泛素激活酶等應(yīng)用，從而參與廣泛的生物學(xué)功能。關(guān)于蛋白激酶和磷酸酶的發(fā)現(xiàn)(1992年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎)、神經(jīng)系統(tǒng)蛋白激酶的發(fā)現(xiàn)(2000年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎)等已有專一介紹(詳見文獻(xiàn)[12])，這里不再贅述。

(2013年10月14日收稿)■

[1] WARBURG O. Iron, the oxygen carrier of respiration-ferment [J]. Science, 1925, 61(1588): 575-582.

[2] WARBURG O. The chemical constitution of respiration ferment [J]. Science, 1928, 68(1767): 437-443.

[3] SVIRBELY J L, SZENT-GY?RGYI A. The chemical nature of vitamin C [J]. Biochem J, 1932, 26(3): 865-870.

[4] KREBS H A, JOHNSON W A. The role of citric acid in the intermediate metabolism in animal tissues [J]. Enzymologia, 1937, 4: 148-156.

[5] LIPMANN F, KAPLAN N O. A common factor in the enzymatic acetylation of sulfanilamide and of choline [J]. J Biol Chem, 1946, 162: 743-744.

[6] SHAMPO M A, KYLE R A. Hugo Theorell—Nobel Prize for study of enzymes [J]. Mayo Clin Proc, 1998, 73(2): 147.

[7] HUTTON R L, BOYER P D. Subunit interaction during catalysis. Alternating site cooperativity of mitochondrial adenosine triphosphatase [J]. J Biol Chem, 1979, 254(20): 9990-9993.

[8] ABRAHAMS J P, LESLIE A G, LUTTER R, et al. Structure at 2.8 A°resolution of F1-ATPase from bovine heart mitochondria [J]. Nature, 1994, 370(6491): 621-628.

[9] SKOU J C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves [J]. Biochim Biophys Acta, 1957, 23(2): 394-401.

[10] HERSHKO A, CIECHANOVER A, ROSE I A. Resolution of the ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes: a component that interacts with ATP [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76(7): 3107-3110.

[11] KRESGE N, SIMONI R D, HILL R L. The Discovery of Ubiquitinmediated Proteolysis by Aaron Ciechanover, Avram Hershko, and Irwin Rose [J]. J Biol Chem, 2006, 40(281): e32.

[12] 郭曉強(qiáng), 王躍民. 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與諾貝爾獎[J]. 自然雜志, 2013, 35(4): 274-285.

(編輯：沈美芳)

中美科學(xué)家揭示人類衰老的關(guān)鍵驅(qū)動力

人類為什么會衰老？中美兩國科學(xué)家的一項(xiàng)新研究顯示，一種叫做異染色質(zhì)的致密型染色體結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，可能是關(guān)鍵原因。這項(xiàng)成果為延緩衰老及防治衰老相關(guān)疾病提供了新思路。

中國科學(xué)院生物物理研究所劉光慧實(shí)驗(yàn)室、北京大學(xué)湯富酬實(shí)驗(yàn)室以及美國索爾克研究所胡安?卡洛斯?伊斯皮蘇亞?貝爾蒙特實(shí)驗(yàn)室于2015年4月30日在美國《科學(xué)》雜志上發(fā)表了他們有關(guān)干細(xì)胞衰老機(jī)理的突破性研究成果。

劉光慧說，當(dāng)前的衰老理論認(rèn)為，衰老主要源于細(xì)胞內(nèi)不斷聚集的DNA損傷，而新發(fā)現(xiàn)是對這一理論的補(bǔ)充。

他說：“我們提出了‘異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)失序’是人類干細(xì)胞衰老的驅(qū)動力這一新的理論。此外，我們在異

自然信息染色質(zhì)水平確立了可抑制人類細(xì)胞衰老的新型分子靶標(biāo)。”

人類的自然衰老進(jìn)程有幾十年，無法在實(shí)驗(yàn)室中研究，而實(shí)驗(yàn)鼠的衰老研究模型不能真實(shí)反映人類的衰老進(jìn)程以及人類對疾病和藥物的易感性。因此，劉光慧等人選擇建立人類成年早衰癥的干細(xì)胞模型，從而使衰老研究變得簡單。

成年早衰癥是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，由WRN基因的突變所致，患者表現(xiàn)為在青春期就提前衰老，并伴發(fā)多種老年疾病。

研究人員首先通過基因組靶向編輯技術(shù)，使人類干細(xì)胞中的WRN基因發(fā)生突變，在實(shí)驗(yàn)室中培育出具有成年早衰癥特征的干細(xì)胞。這種干細(xì)胞不僅表現(xiàn)出生長速度減慢、DNA損傷反應(yīng)加劇和分泌大量炎性因子等衰老特征，而且表現(xiàn)出異染色質(zhì)的加速缺失。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WRN蛋白與異染色質(zhì)蛋白SUV39H1、HP1α共存于一個蛋白質(zhì)復(fù)合體中，該復(fù)合體能維持異染色質(zhì)穩(wěn)定從而阻止干細(xì)胞衰老，但WRN的缺失會導(dǎo)致異染色質(zhì)穩(wěn)定性降低，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞衰老。

通過比較健康老年人和年輕人體內(nèi)分離的干細(xì)胞，也可見老年人干細(xì)胞中WRN平的下調(diào)以及異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的異常，說明異染色質(zhì)的重塑可能是正常細(xì)胞衰老的驅(qū)動力之一。

劉光慧等人還發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)HP1α蛋白質(zhì)能抑制細(xì)胞加速衰老，這為未來干預(yù)人類干細(xì)胞的衰老提供了可能的分子靶標(biāo)。

劉光慧說：“衰老是人類疾病最大的危險因子。有別于針對某種特定衰老相關(guān)疾病的治療，理論上對人類衰老進(jìn)程的干預(yù)(延緩衰老)可能從根本上抑制多種衰老相關(guān)疾病的發(fā)生，因此具有巨大的科學(xué)研究和治療意義。”

[關(guān)毅 編譯]

Enzymes and life sciences (Ⅱ): Studies on oxidase and ATPase

GUO Xiaoqiang
Department of Chemical Engineering, Shijiazhuang Vocational Technology Institute, Shijiazhuang 050081, China

Biological oxidation is the base of energy production in life, also is the basic guarantee of life which can be maintained. The discovery of cytochrome oxidase opened the prelude of modern biological oxidation research. Then, a large number of oxidases were identified to deepen the understanding of oxygen utilization. On the other side, the identification of dehydrogenases and cofactors further enhances the understanding of nature of biological oxidation process, that is, hydrogen and oxygen are combined to form water and to release energy to promote ATP production. The discoveries of ATP synthase and Na+, K+-ATP enzyme promote the researches on mechanism of ATP generation and utilization. The catalysis of many enzymes required ATP, such as ubiquitin related enzymes, so the researches on these enzymes expanded the understanding on intracellular metabolism. In this paper, the development process of biological oxidation (also known as bioenergetics) was described to show the importance of oxidases and ATPases.

biological oxidation, oxidase, dehydrogenase, ATP synthase, ATPase

10.3969/j.issn.0253-9608.2015.03.006

?通信作者，E-mail：xiaoqiangguo123@163.com