屈雙麗，楊曉敏

0 引 言

原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)重要的體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其為建造心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程的模型及探討基因、蛋白質(zhì)及信號通路的變化提供重要的基礎(chǔ)保障。此外，在體內(nèi)心肌細(xì)胞的活動受到神經(jīng)、體液等多方因素的影響，限制對其病理變化的過程的研究。而體外培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞不僅具有心肌細(xì)胞固有的活性，而且還有不受神經(jīng)、體液等因素的影響的可控制性。因此，原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)的好壞，是影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。本研究通過比較不同消化時(shí)間對原代心肌細(xì)胞的影響，探討一套簡便易行、成活率高的原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選擇出生1 ～2 d 的Wistar 大鼠，清潔級，雌雄不限，由內(nèi)蒙古大學(xué)動物研究中心提供，合格證編號:csxk(蒙)2002-0001。楊木小刨花墊窩，濕度45%～50%，溫度控制在21 ～27 ℃。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM 高糖培養(yǎng)基(含100 U 青霉素+鏈霉素雙抗)、胎牛血清、Ⅱ型膠原酶(Worthington 公司，美國)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、臺盼藍(lán)染色液;5-溴-2-脫氧尿苷(Brdu)、4%多聚甲醛、過氧化酶阻斷溶液、羊血清、α-actin 抗體(兔抗大鼠)、二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒、SABC(鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法)免疫組化試劑盒、Mayor's 蘇木精、二甲苯、TritonX.100(生工生物工程有限公司，中國)、37 ℃恒溫浴鍋、醫(yī)用超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、恒溫離心機(jī)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 ①將大鼠浸沒在75%乙醇中消毒2 次，左手固定乳鼠暴露胸部，右手持眼科剪沿其胸骨左側(cè)剪開，壓住肺葉，心臟收縮時(shí)可見其膨出。眼科鑷鈍性分離下心臟，放入有10 mL 10%DMEM培養(yǎng)基(含雙抗)的培養(yǎng)皿中。②在第1 個(gè)培養(yǎng)皿中擠出心臟的積血并鈍性分離出1/2 ～2/3 心室下半部分，依次在第2、3 個(gè)平皿中洗滌后放入小燒杯中，用眼科剪快速將所有心臟剪成約1 mm3小塊。③取5 mL 消化液放入小燒杯，并輕晃燒杯5 ～8 次，棄去消化液。再次放入3 mL 消化液，用直頭吸管將燒杯中的混合物轉(zhuǎn)移到有膠塞的玻璃管中，并將其置于37 ℃水浴鍋中并不斷晃動8 ～10 min，隨后棄去消化液。④取新消化液5 mL 加入到玻璃管中，37℃水浴并晃動8 ～10 min。將組織消化液移入50 mL離心管，在此之前管中先放入20 mL 已溫育的含20%FBS 的DMEM(H+)，并混勻終止消化。重復(fù)此步驟6 ～7 次，直到組織快消化為白色絮狀物為止。⑤將收集的消化液800 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清。向離心沉淀中加入含10%FBS 的DMEM(H+)10 mL 混勻，用300 目濾網(wǎng)過濾。將濾液放入培養(yǎng)瓶中，于37 ℃孵箱中孵育90 min，差速貼壁90 min 后取出培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，將上層懸濁液混勻移入孔板中(8 min 和10 min 接種濃度相同)，以每1 mL 培養(yǎng)基中加入10 μLBrdu，繼續(xù)溫箱培養(yǎng)，24 h 后更換10%FBS DMEM(H+)。⑥取出細(xì)胞爬片用PBS 緩沖液洗滌2 次，吸去PBS 后加入適量4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水洗滌2 min×2 次，吸干，加入適量蘇木精染色液室溫下染色8 min，流動水沖洗約10 min 后吸干，蒸餾水洗滌1 次后浸入95%乙醇5 s，吸干后加入適量伊紅染色液室溫下染色30 min，70%乙醇洗滌2 次，吸干后置室溫下晾干。

1.4 原代心肌細(xì)胞活力測定 ①臺盼藍(lán)染色法:取細(xì)胞懸濁液100 μL，加入100 μL 臺盼藍(lán)溶液(2×)，混勻。其鏡下表現(xiàn)為死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。取10 μL 用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)4 個(gè)大格中的活細(xì)胞總數(shù)和染成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)。使用血球計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下分別計(jì)數(shù)分離純化前和分離純化后的細(xì)胞成活率，分別計(jì)數(shù)3 次，取其平均值。計(jì)算公式:

細(xì)胞存活率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%

②比較8 min 和10 min 消化時(shí)間下原代心肌細(xì)胞的活力:在倒置顯微鏡下觀察胞搏動頻率，每次觀察10 個(gè)細(xì)胞取平均值，對2 種消化時(shí)間下原代心肌細(xì)胞搏動頻率進(jìn)行比較。

1.5 原代心肌細(xì)胞的鑒定 制作細(xì)胞爬片，培養(yǎng)48 h后取出，采用橫紋肌肌動蛋白(α-actin)作免疫染色，進(jìn)行心肌細(xì)胞的鑒定。α-actin 為一抗，同時(shí)用PBS作為一抗進(jìn)行對照。取爬片，4%多聚甲醛室溫固定、0.1%Triton100 室溫孵育穿透及滅活內(nèi)源性過氧化物酶各30 min 后，滴加1∶100 的α-actin 抗體(兔IgG)，4 ℃過夜，孵育二抗20 min，最后DAB 顯色，蘇木精輕度復(fù)染。封固后，顯微鏡下拍照。

1.6 建立心肌肥大模型 原代心肌細(xì)胞孔板中加入血管緊張素II(Angiotensin II，Angll)，使其終濃度為10-5mmoI/L，形成心肌肥大模型(即實(shí)驗(yàn)組);對照組加入相同體積的10%FBS DMEM(H+)培養(yǎng)液，作用48 h 后，采用RT-PCR 技術(shù)觀察原代心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志性基因心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA 表達(dá)變化［1］。培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化懸浮后，在相同相差顯微鏡下拍攝照片，用圖像處理系統(tǒng)測量細(xì)胞的截面面積。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

2.1.1 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞部分貼壁，多呈圓形、梭形及三角形。培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞基本上全部貼壁，并呈有自發(fā)搏動，8 min 及10 min 消化時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常。培養(yǎng)48h后，8 min 消化時(shí)間的細(xì)胞少量伸出偽足，多呈三角形及多邊形，而10 min 消化時(shí)間的細(xì)胞大部分伸出偽足相互接觸交織成網(wǎng)，逐漸形成細(xì)胞簇，立體感明顯，細(xì)胞搏動及收縮均較明顯而有力。

2.1.2 HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成淡紅色，核膜較為清晰。原代心肌細(xì)胞數(shù)量較多呈簇狀聚集，細(xì)胞呈多角形、伸出多量偽足，細(xì)胞核豐滿、大小均勻，細(xì)胞質(zhì)豐富且著色均勻，見圖1a、b。心肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成淡紅色，細(xì)胞核膜較為清晰，平坦，細(xì)胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明而薄，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，顏色淡，見圖1c。

圖1 原代心肌細(xì)胞形態(tài)圖Figure 1 Morphology of primary cardimyocytes after digested for different times

2.2 心肌細(xì)胞活力檢測結(jié)果

2.2.1 臺盼藍(lán)染色結(jié)果 分離純化前活細(xì)胞的平均存活率＞90%，消化8 min 組和10 min 組比較未見明顯區(qū)別(P ＞0.05)。分離純化后活細(xì)胞的平均存活率也＞90%，且10 min 組的平均存活率高于8 min 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。

表1 不同消化時(shí)間心肌細(xì)胞分離純化前后平均存活率的比較，%)Table 1 Mean survival rate of cardimyocytes after digested for different times，%)

表1 不同消化時(shí)間心肌細(xì)胞分離純化前后平均存活率的比較，%)Table 1 Mean survival rate of cardimyocytes after digested for different times，%)

與8 min 組比較，#P ＜0.05

組別 分離純化前 分離純化后8 min 組93.5±0.9 93.0±0.8 10 min 組 93.0±1.7 95.4±0.8#

2.2.2 原代心肌細(xì)胞搏動 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，2 種消化時(shí)間的細(xì)胞搏動均達(dá)40 ～50次/min;細(xì)胞培養(yǎng)5 d 后，發(fā)現(xiàn)8 min 消化時(shí)間的細(xì)胞搏動的數(shù)量及次數(shù)均明顯減少，而10min的細(xì)胞搏動未見明顯變化。

2.3 免疫組化結(jié)果 原代心肌細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)呈深棕色，8 min 和10 min 消化時(shí)間的細(xì)胞陽性率均＞95%，而心肌成纖維細(xì)胞呈陰性反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)無棕色顆粒，見圖2。

圖2 不同消化時(shí)間心肌細(xì)胞免疫組化鏡下結(jié)果(×10)Figure 2 Immunohistochemical results of primary cardimyocytes after digested for different times(×10)

2.4 細(xì)胞截面平均面積 10 min 消化時(shí)間的原代心肌細(xì)胞ANP 的CT 值比較，實(shí)驗(yàn)組較對照組表達(dá)顯著升高(P ＜0.05)，而內(nèi)參GADPH 的CT 值比較，實(shí)驗(yàn)組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。Angll 作用原代心肌細(xì)胞48 h 后，實(shí)驗(yàn)組較對照組細(xì)胞截面平均面積比較明顯增加(P ＜0.05)，而8 min的原代心肌細(xì)胞截面面積和ANP 值未見顯著變化(P ＞0.05)。

表2 肥大模型中各組相關(guān)指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of relevant indexes between the experimental and control groups of cardiac hypertrophy models

表2 肥大模型中各組相關(guān)指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of relevant indexes between the experimental and control groups of cardiac hypertrophy models

與對照組比較，*P ＜0.05

組別 ANP(CT 值)GADPH(CT 值)截面平均面積(μm2)對照組15.8±0.5 32.74±0.58 14.11±4.29實(shí)驗(yàn)組 20.8±0.7* 32.53±0.88 34.77±8.43*

3 討 論

原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)為建立心肌模型提供有效的技術(shù)手段，并逐漸趨于成熟。自1960 年Harary 等［2］首次成功的培養(yǎng)出Wister 乳鼠的原代心肌細(xì)胞起，國內(nèi)外許多學(xué)者對心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法不斷地進(jìn)行研究及改進(jìn)，并取得一定成果?，F(xiàn)有資料顯示，影響原代心肌細(xì)胞成活率及活性的主要因素有消化溫度、消化酶及消化時(shí)間。目前，消化酶的選擇主要有2 種，即單獨(dú)使用胰酶［3-4］和胰酶+膠原酶合用［5-6］。胰酶能分解組織間質(zhì)的蛋白成分，膠原酶的作用是特異性地水解細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維，因胰酶作用較強(qiáng)易破壞細(xì)胞膜，而膠原酶作用緩和，近年來主要采用胰酶和膠原酶合用來進(jìn)行消化。在選用胰酶+膠原酶的實(shí)驗(yàn)中多數(shù)采用其最適溫度37℃進(jìn)行消化，或單獨(dú)應(yīng)用胰酶4 ℃過夜［7］，采用其較弱的活性充分分解心肌組織間質(zhì)，之后在應(yīng)用膠原酶進(jìn)行消化，以減少對細(xì)胞膜的損傷，提高細(xì)胞的成活率和活性。

原代細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)的步驟已趨于成熟，本研究在結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)室條件及環(huán)境下進(jìn)行反復(fù)摸索，得到了一套簡便易行并且能或得較高成活率、純度及活性的原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法。同時(shí)，在其他操作條件不變的情況下，探討不同消化時(shí)間如8 min及10 min 對原代心肌細(xì)胞的成活率、活性的影響。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用了目前有關(guān)原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中相對成熟的步驟，如選擇出生3 d 內(nèi)的乳鼠［8］及采用90 min 差速貼壁法和Brdu 抑制法分離純化細(xì)胞［9-10］等。在消化酶方面，只采用作用較緩和的膠原酶在37 ℃進(jìn)行消化，同時(shí)，采用短時(shí)間多次消化的方式，防止膠原酶消化不徹底，從而增加細(xì)胞的產(chǎn)量。在消化時(shí)間方面，本研究采用8 min 和10 min消化時(shí)間，通過對比發(fā)現(xiàn)，2 組純度鑒定陽性率均達(dá)到95%以上，而8 min 組的細(xì)胞形態(tài)明顯滯后于10 min 組，且10 min 組的存活時(shí)間和存活率顯著高于8 min 組。本研究認(rèn)為采用8 min 消化法獲得的細(xì)胞生存時(shí)間短可能的原因是由于膠原酶消化不徹底，細(xì)胞在震蕩中從組織中分離下來，也可能損傷細(xì)胞膜，所以導(dǎo)致成活率較10 min 低。另一方面，由于細(xì)胞數(shù)量少，接種到孔板中的細(xì)胞濃度低而影響到單個(gè)細(xì)胞的搏動及同步化搏動。最后，利用消化時(shí)間為10 min 心肌細(xì)胞成功的建立心肌肥大模型，AngII 作用48 h 后心肌細(xì)胞即實(shí)驗(yàn)組ANP 和表面積與對照組相比表達(dá)顯著升高和增加，而消化時(shí)間為8 min 的心肌細(xì)胞表面積和ANP 值未見顯著變化。與其他原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)相比，本研究成功的從活性和實(shí)用性方面說明消化時(shí)間是其重要的影響因素。同時(shí)說明，該心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法能夠應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的研究。

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)方法獲取心肌細(xì)胞要注意以下幾個(gè)方面:①選擇有正常生育周期及哺乳周期的育齡期母鼠進(jìn)行生育。因母鼠的狀態(tài)會直接影響幼鼠的成活率和生長狀態(tài)及心臟發(fā)育的狀態(tài);②心肌細(xì)胞培養(yǎng)的過程中要遵守?zé)o菌操作的規(guī)則，用到的器械及玻璃制品要進(jìn)行高壓滅菌。乳鼠也需要在75%乙醇中消毒2 次，取心臟時(shí)應(yīng)快速，以使取出的心臟仍有搏動。此外，還要避免剪破腹腔，防止污染;③丟棄第1 次消化心肌組織的膠原酶，以去除組織中的血細(xì)胞及表面的纖維細(xì)胞;④37 ℃消化時(shí)應(yīng)不斷搖晃使消化液與組織充分混勻;⑤經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，在心肌細(xì)胞培養(yǎng)的最初24 h 內(nèi)越少移動細(xì)胞，其生長狀態(tài)越好。

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