尚雪穎

常用流感病毒實驗室檢測方法的比較

尚雪穎

目的 通過對四種常用流感病毒檢測方法的比較, 確定適用于常規(guī)監(jiān)測及疫情暴發(fā)時的檢測方法。方法 用四種方法對隨機(jī)抽取的50份樣品進(jìn)行檢測, 對結(jié)果進(jìn)行對比分析。結(jié)果 膠體金法雖簡單快速, 但漏檢率較高(20.00%)；RT-PCR法靈敏快捷, 準(zhǔn)確度高(34.00%)；細(xì)胞培養(yǎng)法費用適中,檢出率較高(14.00%)；雞胚培養(yǎng)法檢出率最低(2.00%)。結(jié)論 膠體金法適合疫情現(xiàn)場檢測, RT-PCR法適合實驗室內(nèi)快速檢測, 組織培養(yǎng)法適合常規(guī)監(jiān)測, 雞胚培養(yǎng)法適合流感疫苗生產(chǎn)。

組織培養(yǎng)；雞胚培養(yǎng)；病毒分離；RT-PCR；流感病毒

現(xiàn)在實驗室對流感病毒的檢測手段有很多種, 在本科室常用的方法有膠體金法、細(xì)胞培養(yǎng)法、雞胚培養(yǎng)法、RTPCR法四種。為實際工作中找到最適合的檢測方法, 更及時準(zhǔn)確的提供檢測結(jié)果, 對實驗室常用的四種流感病毒檢測方法進(jìn)行比較。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 檢測樣品 2014年1～4月份本院對就診的流感樣病例(發(fā)熱, 體溫≥38℃, 伴咳嗽或咽痛之一者, 未服用過抗病毒藥物［1］)采集的鼻咽拭子, 隨機(jī)抽取50份。流感病毒采樣管由北京友康恒業(yè)科技有限公司購買。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠體金法 美國QUIDEL公司, QuickVue Influenza A+B Test, 按照試劑盒說明書操作。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)法 MDCK細(xì)胞由遼寧省疾病預(yù)防控制中心提供。樣品前處理：將采樣管漩渦震蕩10 s, 反復(fù)擠壓拭子頭后棄去拭子, 加入青霉素、鏈霉素、制霉菌素, 4℃靜置2 h。細(xì)胞傳代及病毒接種按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其實驗技術(shù)》操作［2］。樣品接種MDCK細(xì)胞培養(yǎng)出的第一代病毒培養(yǎng)液用1%豚鼠血紅血球進(jìn)行微量血凝實驗(haemagglutination assay, HA), HA≥1：8的第一代病毒培養(yǎng)液用血凝抑制法(hemagglutination inhibition, HI)進(jìn)行流感病毒分型鑒定(鑒定試劑盒由國家流感中心提供)。HA＜1：8的第一代病毒培養(yǎng)液再次接種MDCK細(xì)胞增毒, 增毒后HA≥1：8的第二代病毒培養(yǎng)液用HI法進(jìn)行流感病毒分型鑒定, HA＜1：8的第二代病毒培養(yǎng)液用RT-PCR法進(jìn)行流感病毒分型鑒定。第一代病毒培養(yǎng)液HA為陰性的再次接種MDCK細(xì)胞, 盲傳一代后仍為陰性的報告未檢出流感病毒。

1.2.3 雞胚培養(yǎng)法 9～11日齡無特定病原菌(specific pathogen free, SPF)雞胚蛋由北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司購買。雙腔接種法按照郭元吉等所著的《流行性感冒病毒及其實驗技術(shù)》操作［2］。樣品前處理、增毒、盲傳、鑒定方法同組織培養(yǎng)法。

1.2.4 RT-PCR法 病毒RNA提取用Neasy Mini Kit, 熒光擴(kuò)增用上海之江生物科技有限公司的甲型流感病毒核酸測定試劑盒、乙型流感病毒核酸測定試劑盒、甲型流感病毒H1亞型及H3亞型核酸聯(lián)合測定試劑盒、新型甲型流感病毒(H1N1)核酸測定試劑盒, 按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

用四種方法分別對50份鼻咽拭子進(jìn)行檢測, 因檢測所用的鼻咽拭子是-70℃冷凍保存過的, 且拭子上病毒經(jīng)過保存液稀釋, 所以膠體金法檢測結(jié)果陽性偏低, 并且本次檢測使用的膠體金試劑盒只能檢測季節(jié)性人流感A(H1N1亞型和H3N2亞型)以及流感B, 對新H1N1型流感病毒檢測能力還不確定。組織培養(yǎng)法檢測結(jié)果顯示第一代HA為陽性的7個樣品中5個病毒培養(yǎng)液 HA≥1∶32, 2個HA＜1∶8的病毒培養(yǎng)液經(jīng)增毒后HA≥1∶16。雞胚培養(yǎng)法只檢測出1個HA為陽性的樣品, 且增毒后仍然HA＜1∶8, 用RT-PCR法鑒定出亞型。組織培養(yǎng)法和雞胚培養(yǎng)法檢測HA為陰性的樣品經(jīng)盲傳后HA仍為陰性。RT-PCR法檢測為陰性的樣品其他方法檢測也都為陰性, 其他方法檢測為陽性的樣品RT-PCR法無漏檢, 說明此法準(zhǔn)確率最高。采用不同檢測方法檢測結(jié)果為陽性的同一份樣品, 鑒定結(jié)果均為同型流感病毒。結(jié)果顯示RT-PCR法檢出率最高, 雞胚培養(yǎng)法檢出率最低。見表1。

表1 四種檢測方法50例樣本檢驗結(jié)果比較(n, %)

3 討論

四種檢測方法各有優(yōu)缺點：①膠體金法。優(yōu)點：操作方法簡單, 耗時短(≤20 min)；不需儀器設(shè)備, 方便攜帶, 適合有疫情爆發(fā)時現(xiàn)場快速檢測；平均每份樣品費用低；缺點：漏檢率高, 且只能鑒定出流感病毒的A、B型, 不能進(jìn)行亞型鑒定。②細(xì)胞培養(yǎng)法。優(yōu)點：細(xì)胞可大量繁殖, 受外界影響小, 經(jīng)濟(jì)方便；分離到的病毒抗原性和基因特性比雞胚分離到的更接近原始采集到的樣本［2］。缺點：病毒不能長期保存, 病毒培養(yǎng)液隨保存時間延長滴度下降；傳代細(xì)胞含致癌因子, 不能用于疫苗生產(chǎn)；隨著細(xì)胞傳代增加, 對病毒敏感性下降［2］；對實驗人員技術(shù)水平要求較高；實驗用試劑耗材費用較高；實驗耗時較長, 一般需3～14 d出具結(jié)果。③雞胚培養(yǎng)法。優(yōu)點：雞胚蛋來源充足, 對正粘病毒敏感, 通常是無菌的, 實驗操作簡單；對病毒不產(chǎn)生抗體, 利于病毒復(fù)制［2］。缺點：無特異性的感染指征；陽性檢出率低, 漏檢率太高；實驗耗時較長, 總費用高, 經(jīng)常需要連續(xù)傳代以提高HA滴度, 費時費力［3］。④RT-PCR法。優(yōu)點：特異性強(qiáng), 靈敏度高,病毒含量很低的樣品也能檢出；實驗耗時短(4 h內(nèi)能出具初步鑒定結(jié)果)；可對HA＜1：8或HI結(jié)果不明確的病毒培養(yǎng)液進(jìn)行鑒定。

綜上所述, 在有流感疫情爆發(fā), 需要進(jìn)行現(xiàn)場檢測時,適合使用膠體金法；需要快速出具準(zhǔn)確診斷結(jié)果時, 適合使用RT-PCR法；組織培養(yǎng)法適合常規(guī)監(jiān)測；雞胚培養(yǎng)法適合流感疫苗生產(chǎn)。

［1］ 趙慧, 江征, 李娟, 等.流感病毒中和抗體檢測方法的建立及驗證.中國生物制品當(dāng)雜志, 2014, 27(9):1109-1201, 1206.

［2］ 郭元吉, 程小雯.流行性感冒病毒及其實驗技術(shù).北京：中國三峽出版社, 1997:87-96.

［3］ 馬輯紅, 何華, 高楓, 等.流感病毒實驗室檢測方法的比較和改進(jìn).中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2006, 16(9):1131-1141.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.30.215

2015-05-13］

124010 遼寧盤錦檢驗檢測中心（市疾病預(yù)防控制中心）