李國松 赫明堂 馬立峰 楊延軍 許思亮 張子清

大鼠跟腱異位骨化模型中低氧誘導(dǎo)因子-1α及血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)及作用

李國松 赫明堂 馬立峰 楊延軍 許思亮 張子清

目的 通過觀測大鼠異位骨化模型中低氧誘導(dǎo)因子-1α( hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達(dá)變化, 探討HIF-1α、VEGF信號通路在異位骨化發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法 SD大鼠60只隨機(jī)分為實驗組和對照組, 各30只, 實驗組制備異位骨化模型。于 5、10 周取跟腱組織, RT-PCR及免疫印跡試驗(Westen-blot)檢測兩組局部組織中HIF-1α及VEGF表達(dá)水平。結(jié)果 術(shù)后5、10周對照組 HIF-1α及VEGF表達(dá)量均顯著低于實驗組(P＜0.05)。結(jié)論 在大鼠跟腱異位骨化早期, HIF-1α及VEGF表達(dá)明顯升高, 提示其對異位骨化發(fā)生、發(fā)展有重要作用。

低氧誘導(dǎo)因子； 血管內(nèi)皮生長因子；異位骨化；大鼠

異位骨化是骨科領(lǐng)域中一種十分常見的疾病。研究表明HIF-1α可激活VEGF的表達(dá), 在骨修復(fù)方面發(fā)揮重要作用［1］。本研究通過 建立大鼠跟腱異位骨化模型, 觀察創(chuàng)傷早期不同時間點局部組織中HIF-1α及VEGF水平變化, 初步探討HIF-1α及VEGF在異位骨化發(fā)生、發(fā)展中的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8齡雄性SD大鼠 60只, 平均體重(131.4± 11.6)g, SPF級環(huán)境飼養(yǎng)(深圳北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心)。

1.1.2 主要試劑 HIF-1α多克隆抗體試劑盒, 抗鼠二抗, TRIzol、DNA Marker, 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

1.1.3 主要儀器 PCR 擴(kuò)增儀GeneAmp9600, 紫外線分光光度儀, Odyssey 紅外線掃描成像系統(tǒng), 瓊脂糖凝膠顯像系統(tǒng)4100、天能凝膠成像和分析系統(tǒng)4100。

1.2 動物模型制備及分組 60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為實驗組和對照組, 每組30只。實驗組：無菌條件下,于大鼠右后肢作后外側(cè)入路暴露跟腱, 用血管鉗反復(fù)鉗夾5次, 造成一定創(chuàng)傷, 然后在中點將跟腱完全切斷, 不予縫合,關(guān)閉切口。對照組：同實驗組方法暴露跟腱, 不作任何處理,直接關(guān)閉切口。

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 術(shù)后觀察兩組大鼠成活、切口愈合情況。各時間點觀察兩組大鼠跟腱大體形態(tài)。

1.3.2 免疫印跡試驗(Western-blot)檢測HIF-1α及VEGF蛋白含量 RT-PCR檢測HIF-1α及VEGF基因表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 所有大鼠均存活至實驗完成, 切口愈合良好。術(shù)后10周, 實驗組跟腱組織可見軟骨樣組織；對照組跟腱組織未見軟骨樣組織。

2.2 HIF-1α及VEGF蛋白及基因檢測 各時間點實驗組HIF-1α及VEGF的蛋白含量及基因相對表達(dá)量均顯著高于對照組, 比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實驗組組內(nèi)不同時間點比較, HIF-1α及VEGF基因相對表達(dá)量各時間點比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 HIF-1α、VEGF的蛋白及基因檢測結(jié)果( x-±s, α=0.05, OD值)

3 討論

異位骨化的發(fā)生、發(fā)展過程中, 呈明顯的連續(xù)性。HIFs是組織細(xì)胞在低氧狀態(tài)下誘生的轉(zhuǎn)錄因子, 包括3種亞型(HIF-1、HIF-2、HIF-3)?，F(xiàn)在的研究集中于HIF-1及其感應(yīng)元件HIF-1α［2］, 在血管重塑、葡萄糖和能量代謝、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞增殖、凋亡等方面發(fā)揮重要作用。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factors, HIFs)是誘導(dǎo)低氧基因和修復(fù)細(xì)胞氧內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的核心因子。

籍骨生長模型, 針對生長板區(qū)域的HIF-1α含量及其變化特性的研究發(fā)現(xiàn), 生長板軟骨細(xì)胞外基質(zhì)呈梯度性缺氧狀態(tài), 誘導(dǎo)HIF-1α呈不同水平的表達(dá), 其中央部位尤甚；軟骨細(xì)胞HIF-1α基因條件性敲除后, 生長板中央處軟骨細(xì)胞死(凋)亡。指出適量水平的HIF-1α可使軟骨細(xì)胞尤其是早期肥大細(xì)胞存活期延長而使基質(zhì)鈣化逐漸彌散。當(dāng)進(jìn)行性升高的HIF-1α達(dá)一定程度, 便會通過信息呈遞和(或)其主要靶基因-VEGF及其受體Flt-1(fms-like tyrosine kinase)、KDR(kinase domain region)介導(dǎo), 誘導(dǎo)血管侵入, 有效的屏障作用而因此喪失, HIF-1α被降解, 如此交替, 這有可能是透明軟骨雛形和出生后生長板軟骨細(xì)胞分裂、增殖、肥大、變性、壞死和軟骨基質(zhì)的鈣化, 有序而規(guī)律的主要調(diào)節(jié)機(jī)制［3,4］。對這些現(xiàn)象進(jìn)一步的研究表明： HIF-1α在骨折修復(fù)重建過程中, 對軟骨內(nèi)成骨發(fā)揮了相同或類似的調(diào)節(jié)作用。

在HIF-1α的作用下, 其下游最關(guān)鍵的因子之一, VEGF已經(jīng)被證明可以促進(jìn)成肌細(xì)胞分化, 并增加其血管化和預(yù)防凋亡［5］。闡明其中的細(xì)胞分子生物學(xué)行為表現(xiàn)形式及其規(guī)律,將有可能成為加深認(rèn)識創(chuàng)傷后異位骨化的生物學(xué)機(jī)制及其病損防治的新突破。因此, 自1992年發(fā)現(xiàn)HIFs以來, 這一反映生命活動氧依賴機(jī)制通路的重要組成部分, 其意義和前景倍受生命科學(xué)研究領(lǐng)域關(guān)注。

實驗研究已經(jīng)表明在未有其他干預(yù)條件下, HIF-1α能促進(jìn)VEGF的表達(dá), 從而促進(jìn)血管化, 明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞生成。本實驗檢測異位骨化過程中HIF-1α及VEGF的表達(dá),初步探討HEF-1α及VEGF對異位骨化的調(diào)控作用及其發(fā)生機(jī)制。這不僅有助于加深認(rèn)識異位骨化形成機(jī)制, 發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致異位骨化的問題所在, 而且將為提出新的治療和防治創(chuàng)傷后異位骨化的措施提供可能。

［1］ 陳博, 陳劍秋.HIF-1α轉(zhuǎn)染骨骼肌細(xì)胞的誘導(dǎo)產(chǎn)物VEGF對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2010, 16(3): 420-423.

［2］ 邵進(jìn), 鄧廉夫.VHL/HIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨發(fā)育及其相關(guān)疾病中的調(diào)控機(jī)制.國際骨科學(xué)雜志, 2009, 30(4):254-256, 260.

［3］ 朱海云, 李銀平.缺氧誘導(dǎo)因子及其在炎癥中的作用進(jìn)展.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志, 2010, 17(1):60-62 .

［4］ 張綱, 李焰, 譚穎徽.細(xì)胞生長因子在骨折愈合中的作用研究進(jìn)展.重慶醫(yī)學(xué), 2008, 37(2):196-197.

［5］ 徐用億, 馬金忠.骨性關(guān)節(jié)炎中組織血管發(fā)生的研究進(jìn)展.生物骨科材料與臨床研究, 2010, 7(1):33-35.

Expressions and effects of hypoxia inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor in rat Achilles tendon heterotopic ossification model

LI Guo-song, HE Ming-tang, MA Li-feng, et al.
Guangdong Shenzhen City Longgang District Orthopaedic Hospital, Shenzhen 518116, China

Objective To observe expression changes of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in rat Achilles tendon heterotopic ossification model, and to investigate effects of HIF-1α and VEGF signal path in occurrence and progression of heterotopic ossification.Methods A total of 60 SD rats were randomly divided into experimental group and control group, and each group contained 30 cases.Heterotopic ossification model was made in the experimental group.Achilles tendon tissues were taken in 5 and 10 weeks for detection of HIF-1α and VEGF expression levels by RT-PCR and Western-blot test.Results In 5 and 10 weeks after operation, the control group had obviously lower HIF-1α and VEGF expression levels than the experimental group (P＜0.05).Conclusion Remarkably increased HIF-1α and VEGF expression levels in early stage of rat Achilles tendon heterotopic ossification provides important effects for occurrence and progression of heterotopic ossification.

Hypoxia inducible factor; Vascular endothelial growth factor; Heterotopic ossification; Rat

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.14.191

2015-01-12］

518116 廣東省深圳市龍崗區(qū)骨科醫(yī)院