安新煥 武會娟 梁干雄

·實驗研究·

PCR-RLFP方法檢測eNOS G894T多態(tài)性實驗條件研究

安新煥 武會娟 梁干雄

目的 探討聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術檢測內皮細胞型一氧化氮合酶(eNOS) G894T多態(tài)性的最佳實驗條件。方法 對PCR和RFLP的一些影響因素進行研究。結果 PCR擴增eNOS基因的最佳條件為：20 μmol/L的引物濃度； 5.0 U的Taq酶量； 112 μmol/L的dNTP濃度。20 μl體系中加4 μl產物, 5.0 U的酶消化4 h為最經濟有效的酶切體系。結論 最佳的實驗條件的探索是進行大批量實驗研究的關鍵。

內皮細胞型一氧化氮合酶；G894T；多態(tài)性； 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性；最佳實驗條件

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM) 患者致命的主要原因之一 。并非所有的DM患者均發(fā)生DN, 有些患者盡管血糖控制良好, 卻發(fā)生腎損害［1］；有半數(shù)以上DM患者無論血糖控制如何終生不發(fā)生DN, 此種異質性不能用代謝調節(jié)的差異來解釋 。因此提示遺傳因素在DN或至少在部分DN的發(fā)病中起重要作用。有研究表明, eNOS基因是DN的候選基因。在腎臟, eNOS 主要存在于血管內皮細胞, eNOS 是血管內皮細胞NO 合成的主要限速因子, eNOS 的功能障礙將影響血管壁NO 基礎水平, 影響糖尿病微血管病變的發(fā)生。血漿NO 水平的變化30%是由于eNOS 基因多態(tài)性所致。eNOS 基因第7 外顯子G894T多態(tài)性, 可影響eNOS 蛋白功能, 使血漿NO 水平下降, 在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。另有研究表明［2］, eNOS與ACE基因多態(tài)性并存對糖尿病腎病有一定的影響。作者檢測eNOS 基因第7 外顯子G894T多態(tài)性, 并研究分析此種多態(tài)性是否與中國廣東地區(qū)漢族人DN有關系。PCR-RFLP方法借助限制性內切酶對識別堿基序列的特異性切割, 用來檢測基因片段中某一位點的變異情況。eNOS 基因第7 外顯子894位點對應限制性內切酶BanⅡ的酶切位點, 酶切后有3種情況：基因型為GG的不含突變位點, 酶切后為163 bp 和85 bp 兩個片段;TT基因型酶切后只有一個248 bp 片段, 存在G→T 點突變；GT基因型酶切后得到3個片段即248 bp , 163 bp 和85 bp 。

盡管PCR-RFLP是比較成熟的技術, 但對于不同的模板和引物, PCR反應所需的條件是不同的。如果實驗條件把握不準確, 可造成假陰性或假陽性結果, 酶切反應對于產物多少、酶量及酶切時間也有講究, 對于大批量研究而言, 探索實驗條件是必需的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器材料 基因擴增儀BIO-RAD S1000；電泳儀Power Pac 3000型由美國BIO-RAD公司生產及配套的分析軟件和Power Pac1000紫外圖像分析系統(tǒng), 5417R高速冷凍離心機由德國Eppendorf公司生產制造, 恒溫和可控水浴箱由上海醫(yī)療器械廠生產制造。

1.1.2 主要試劑 由北京市理化分析測試中心合成引物：上游引物：5’-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3’, 下游引物5’-CCC AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA-3’ , TaqDNA聚合酶標準為5.0 U/μl、100 mmol/L的dNTP和限制性內切酶BanⅡ均為寶生物(大連)有限公司生產, 從天根生化科技(北京)有限公司購得DNA分子量標記(Marker)。實驗用水為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 模板DNA的抽提 選用QIAamp DNA Mini kit試劑盒按說明書提取模板DNA, 加入100 ml TE緩沖液, DNA沉淀物放在65℃水浴中15～20 min, 直到沉淀物質完全溶解, 儲存方法:放在4℃的冰箱中。

1.2.2 PCR擴增 建立PCR擴增目的DNA片段的實驗條件。模板1 μl, 10×緩沖液5 μl, 加去離子水至501μl作為基本反應體系, 對影響擴增結果的Taq酶量、dNTP、引物的濃度等進行變化, 按94℃預變性5 min, 后94℃ 45 s, 60℃ 45 s, 72℃ 1 min進行30個循環(huán), 最后72℃延伸5 min。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳法檢測：將擴增產物10 μl與溴酚藍加樣緩沖液2 μl混勻后和1份5μl MarKer同時加樣于2%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴乙錠), 用100 V電壓電泳30 min, 電泳后在Gel Doc1000紫外檢測系統(tǒng)中觀察擴增產物的電泳結果。

1.2.3 BanⅡ限制性內切酶的酶解 GG基因型酶切后有2個片段163 bp 和85 bp；TT基因型只有1 個248 bp 的片段；GT基因型酶切后有3個片段即248 bp、163 bp和85 bp。采用過度酶量消化的辦法找到基因型為GG的野生純合子, 即5 μl擴增產物, 用10.0 U的內切酶消化, 反應體系20 μl, 然后20 μl總反應體系不變, 對擴增產物量、內切酶的濃度、酶切時間按梯度設定。酶切后產物的檢測也采用瓊脂糖凝膠電泳法,按上述同樣方法進行加樣, 10 μl酶切產物在80 V電壓下電泳45 min, 然后在Gel Doc 1000紫外檢測系統(tǒng)中觀察結果。

2 結果

2.1 PCR實驗條件

2.1.1 Taq酶量設定在2.5～15.0 U之間, 其他擴增條件不變。結果表明, 不同酶量均能擴增出目的DNA片段, 且產物量無顯著性差異。所以選擇5.0 U的Taq酶量, 既有效又節(jié)省酶量。見圖1。

2.1.2 引物濃度設計在10～100 pmol/ul, 其他條件不變。結果是均有產物擴出, 但隨著引物濃度增加, 引物二聚體也逐漸增加, 產物量并不增加, 所以選擇引物濃度20 pmol/ul, 此時二聚體較少, 產物量高。見圖2。

2.1.3 dNTP濃度設計在28～168 μmol/L之間, 其他擴增條件不變。結果是隨著dNTP濃度的增加產物量有所增加, 但在112 μmol/L后產物量并無變化, 選擇其最適dNTP濃度為112 μmol/L。見圖3。

圖1 Taq酶量對PCR的影響注：M為D2000的DNA分子量標記,依次為100、250、500、750、1000、2000 bp；1～6分別為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 以及15.0 U的Taq酶量

圖2 引物濃度對PCR的影響注：M為D2000的DNA分子量標記,依次為100、250、500、750、1000、2000 bp；1～6分別為10、20、30、40、50以及100 pmol/ul的引物濃度

圖3 dNTP濃度對PCR擴增的影響注：M為D2000的DNA分子量標記, 依次為100、250、500、750、1000、2000 bp；1～6分別為：28、56、84、112、140和 168 μmol/L的dNTP濃度

2.2 BanⅡ內切酶實驗條件

2.2.1 酶切反應體積 50 μl的酶切體系是一般試劑盒的標準體系, 而RFLP只需要酶切后電泳檢測得出酶切圖譜, 無后續(xù)實驗需要, 因此設定反應體積為20 μl即可滿足要求。

2.2.2 確定酶切所用的擴增產物量 選擇GG基因型的擴增產物來酶切, 10.0 U內切酶, 分別消化2～8 μl的擴增產物,過夜酶切。結果表明：2、4、6、8 μl的擴增產物均可被切開,但6、8 μl的擴增產物酶切后雖不影響基因型判斷, 但遺留極少量未被切干凈的痕跡, 2 μl擴增產物酶切后電泳無法分辨基因型, 而4 μl時結果清晰可辨。所以最佳酶切產物量為4 μl, 既能保證酶切完全又防止擴增產物過多對內切酶抑制。見圖4。

2.2.3 酶切的酶量確定 加入4 μl擴增產物量, 2.5～10.0 U將內切酶量設計為4個梯度, 過夜酶切。結果表明：5.0、7.5、10.0 U時均呈現(xiàn)清晰的163 bp一條片段(因為85 bp片段看不到), 而2.5 U的酶量不能完全切開, 所以選擇5.0 U內切酶量。見圖5。

2.2.4 酶切時間的確定 反應體積為20 μl, 加入4 μl擴增產物, 5 U內切酶, 酶切時間設置為1～10 h。結果表明：1 h酶切不能完全切割, 248 bp處遺留少量痕跡, 而4 h后可以完全切割, 248 bp處不留痕跡, 而且隨酶切時間延長并未發(fā)現(xiàn)非特異性切割, 所以最佳酶切時間為4 h。見圖6。

圖4 擴增產物量對酶切的影響注：M為D2000的DNA分子量標記, 依次為100、250、500、750、1000、2000 bp；1、2、3、4依次為酶切模板8、6、4、2 μl

圖5 內切酶量對酶切的影響注：M為D2000的DNA分子量標記, 依次為100、250、500、750、1000、2000 bp ；1、2、3、4依次為內切酶2.5、5.0、7.5、10.0 U的BanⅡ內切酶量

圖6 酶切時間的確定注：D2000為DNA分子量標記, 依次為100、250、500、750、1000、2000 bp ；1、2、3、4 分別為酶切1、4、7、10 h

3 討論

PCR-RFLP方法是常用的檢測點變異的方法, 實驗條件隨著內切酶及切割片段長度的不同而不同, 而對于大批量實驗而言, 若要保證實驗結果準確可靠, 實驗條件需要優(yōu)化。

擴增后的產物需要酶切后才能判斷基因型, 因此擴增產物要求量足又要特異性高, 引物二聚體較少。對于實驗條件的諸多影響因素, 作者選擇主要的影響因素如Taq酶量、引物濃度以及dNTP濃度等進行實驗條件的優(yōu)化。①Taq酶量：Taq酶活性對于不同來源和不同批次會有不同, 會影響擴增效果, 所以, 同一研究中最好使用同一批次的Taq酶。得到的擴增產物量足夠酶切, 出于降低檢測成本考慮, 選擇低濃度的酶即可。②引物濃度：引物濃度對擴增效率和特異性均有影響。引物濃度低擴增效率極低, 不能滿足實驗要求, 引物濃度過高, PCR反應特異性下降, 錯配增加, 引物二聚體增多［3］。③dNTP的濃度：PCR擴增體系中有4種dNTP, 并且要求等摩爾濃度, 否則會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入, 降低新鏈合成速度［4］。dNTP濃度低時反應產量也低, 而dNTP濃度高時對擴增反應有抑制作用, 可能是因為dNTP與Mg2+螯合而引起的反應［4］。④內切酶量以及酶切所用擴增產物量：這兩種條件是密不可分的, 內切酶量和擴增產物量的多少在一個反應體系中是相對而言的, 內切酶量少, 產物切不開或切不完全, 無法判斷結果；擴增產物量多使得內切酶量相對不足, 甚至會對內切酶產生抑制作用［5］, 內切酶量過多又造成浪費, 增加實驗成本。⑤酶切時間：雖然試劑盒上都有參考的酶切時間, 但在不同的反應體系中, 不同的實驗條件下,需要重新確定酶切時間。酶切時間的延長, 并不能減少所用的內切酶量, 反而會因為酶切時間過長而使內切酶酶活性喪失, 甚至會造成內切酶星號活性(在非標準反應條件下切割與內切酶識別順序相似的序列)的發(fā)生［5］, 時間過短又不能完全切割特異性片段, 內切酶的作用也未發(fā)揮完全, 影響結果判斷。電泳時間過長會造成條帶模糊不清, 甚至DNA從凝膠中泳出, 過短會造成片段分不開, 每次電泳時間不一致會造成橫向無法比較。

實驗條件之間互相影響、互相關聯(lián), 優(yōu)化實驗條件后確定了PCR-RFLP方法擴增eNOS 基因第7 外顯子區(qū)進而進行內切酶消化的適宜實驗條件, 為實驗結果的準確可靠奠定了基礎。

總之, PCR擴增eNOS 基因第7 外顯子區(qū)的適宜條件：20 μmol /L的引物濃度；5 U的Taq酶；112 μmol/L的dNTP濃度；BanⅡ酶切的最適條件：20 μl的酶切體系中, 加入4 μl酶切產物, 5.0 U內切酶, 酶切4 h。以上參數(shù)偏離最適條件將會影響實驗結果。

［1］ Dudek AZ, Pawlak WZ, Kirstein MN.Molecular targets in the inhibition of angiogenesis.ExpertOp on Ther Targets, 2003, 7(4): 527-541.

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［3］ 張維銘.現(xiàn)代分子生物學實驗手冊.北京：科學出版社, 2003: 251.

［4］ 薩姆布魯克, 拉塞爾.分子克隆實驗指南.第3版.北京：科學出版社, 2002:599.

［5］ 孫晗笑, 陸大祥, 劉飛鵬.轉基因技術理論與應用.鄭州：河南醫(yī)科大學出版社, 2000:178-179.

Experimental condition research of PCR-RLFP in detection of polymorphism of eNOS G894T

AN Xinhuan, WU Hui-juan, LIANG Gan-xiong.
Department of Endocrinology, Guangdong Zhongshan City People’s Hospital, Zhongshan 528400, China

Objective To investigate the optimum experimental condition of polymerase chain reactionrestricted fragment length polymorphisms (PCR-EFLP) in detection of polymorphism of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) G894T.Methods Research was made on influencing factors of PCR and RFLP.Results The optimum experimental conditions for PCR in amplification of eNOS gene included primer concentration as 20 μmol/L, Taq enzyme amount as 5.0 U, and dNTP concentration as 112 μmol/L.4 μl products in 20 μl system under 4 h of 5.0 U enzymic digestion was the most financial enzymatic system.Conclusion Investigation of the optimum experimental condition is the key to implement large quantities of experiments.

Endothelial nitric oxide synthase; G894T; Polymorphism; Polymerase chain reactionrestricted fragment length polymorphisms; Optimum experimental condition

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.14.190

2015-04-17］

528400 廣東省中山市人民醫(yī)院內分泌科(安新煥 梁干雄)；北京市理化分析測試中心(武會娟)