余景偉 胡克

[摘要] 目的 探討土荊皮酸對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞，用不同濃度的土荊皮酸（0、4、8、16、32 μmol/L）處理24、48、72 h，MTT法測(cè)定其對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響；土荊皮酸（0、4、8、16 μmol/L）處理A549細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期，分光光度計(jì)檢測(cè)Casepase-3相對(duì)活性，Western blot法檢測(cè)PTEN、Akt、p-Akt的表達(dá)。 結(jié)果 土荊皮酸能有效抑制A549細(xì)胞增殖，且呈濃度和時(shí)間依賴性（P < 0.05）；土荊皮酸作用A549細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率從14.8%上升至37.7%，顯著高于對(duì)照組（土荊皮酸0 μmol/L）（P < 0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，土荊皮酸能抑制細(xì)胞的G1期行進(jìn)和G1/S轉(zhuǎn)換；Casepase-3相對(duì)活性顯著增加（P < 0.05）；土荊皮酸可上調(diào)PTEN表達(dá)并抑制p-Akt的表達(dá)（P < 0.05）。 結(jié)論 土荊皮酸可抑制A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制可能與上調(diào)PTEN并抑制Akt信號(hào)通路，繼而阻滯細(xì)胞周期并激活線粒體凋亡途徑相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 土荊皮酸；A549細(xì)胞；凋亡；PTEN；Akt信號(hào)通路

[中圖分類(lèi)號(hào)] R734 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）02（a）-0018-05

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一[1-2]，化療是主要的治療方法，然而傳統(tǒng)的化療藥物毒副作用大，患者難以耐受，且常常出現(xiàn)耐藥情況，治療效果不佳。因此，從天然植物中尋找高效低毒的具有抗腫瘤活性的成分成為了國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。土荊皮酸（Pseudolaric acid B，PAB）是從荊樹(shù)皮中提取的具有多種藥理活性的二萜類(lèi)化合物，前期研究發(fā)現(xiàn)，PAB可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3-4]，然而其抗腫瘤機(jī)制尚不明確，本研究旨在探討PAB對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討PAB可能的抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。主要試劑：PAB購(gòu)于哈爾濱弘博生物科技有限公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和AnnexinV/PI凋亡試劑盒購(gòu)于BENDER公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG均購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；PTEN、Akt、p-Akt（Ser473）及內(nèi)參β-actin抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法，大約每2天換培養(yǎng)基1次，大約3 d傳代1次，每次均取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的并處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞配制成1×104個(gè)/mL的細(xì)胞混懸液，將混懸液按每孔100 μL加入96孔培養(yǎng)板，在孵箱中孵育培養(yǎng)約24 h后取出，棄上清，每孔加200 μL RPMI-1640培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h后取出，棄上清。實(shí)驗(yàn)組換PAB終濃度為2、4、8、16、32 μmol/L培養(yǎng)液，對(duì)照組未加PAB（0 μmol/L），每組5個(gè)復(fù)孔。然后放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24、48、72 h，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h棄孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL MTT（濃度為0.5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)液體，加入100 μL DMSO。振蕩15 min后酶標(biāo)儀測(cè)吸光度（A490），根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞配制成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞混懸液，將懸液接種于6孔板中，在孵箱中孵育培養(yǎng)約24 h后取出，棄上清。實(shí)驗(yàn)組換PAB終濃度為2、4、8、16、32 μmol/L培養(yǎng)液，對(duì)照組未加PAB（0 μmol/L），放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，并將細(xì)胞重懸于Binding Buffer中。加入5 μL Annexin V-FITC室溫、避光反應(yīng)10 min，加入5 μL PI混勻，室溫、避光反應(yīng)5 min。篩網(wǎng)過(guò)濾后，上流式細(xì)胞儀機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞接種及分組同上，收集細(xì)胞，洗滌、離心后加入75%預(yù)冷乙醇固定過(guò)夜，棄掉乙醇，加入RNase和PI室溫避光染色，篩網(wǎng)過(guò)濾后，送上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5 分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性變化 細(xì)胞接種及分組同上，收集細(xì)胞，加入100 μL裂解液+1.742 μL PMSF蛋白酶抑制劑重懸細(xì)胞，用移液器吹打細(xì)胞置混勻，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上裂解約45 min。后12 000 r/min，4℃離心30 min，后吸取上清，并放置于冰上，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒操作方法操作，其原理是基于Caspase-3可催化底物Ac-DEVD-pNA并產(chǎn)生黃色的對(duì)硝基苯胺（p-nitroaniline，pNA），后者可產(chǎn)生吸光度，間接反映細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性。根據(jù)結(jié)果調(diào)好蛋白濃度（2～4 g/L），再加入緩沖液20 μL多次吹打均勻后加入Caspase-3反應(yīng)底物Ac-LEHD-pNA 5 μL，再放置培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，之后酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處吸光值（OD405）。

1.2.6 Western blot檢測(cè)PTEN、Akt和p-Akt（Ser473）蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種及分組同上，收集細(xì)胞，加入100 μL裂解液+1.742 μL苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑重懸細(xì)胞，用移液器吹打細(xì)胞置混勻，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上裂解約45 min。12 000 r/min，4℃離心30 min，后吸取上清，將樣品分裝至預(yù)冷的EP管中，-80℃保存。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入1/5體積的5×上樣緩沖液至提取的細(xì)胞蛋白樣品中，沸水煮沸5 min，-20℃保存。將細(xì)胞蛋白樣品行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（上樣量20 μg/孔），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，再加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，根據(jù)條帶蛋白分布不同加入1∶1000稀釋的兔抗或鼠抗人PTEN、Akt、p-Akt（Ser473）抗體，4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜，其中β-actin為內(nèi)參，次日洗膜緩沖液（TBST）洗膜后，根據(jù)一抗來(lái)源不同分別加入1∶1000稀釋的辣根酶標(biāo)記的山羊抗或山羊抗鼠二抗，室溫放置2 h，再次TBST洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色，暗室內(nèi)顯影并觀察各條帶深淺變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAB對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

如表1所示，PAB對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴性，藥物濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，其發(fā)揮抗腫瘤作用效果亦越好。

2.2 土荊皮酸對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

A549細(xì)胞經(jīng)PAB處理48 h后，流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，PAB各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組（0 μmol/L）的凋亡率（0.6%）明顯升高，從14.8%上升至37.7%，較對(duì)照組的凋亡率（0.6%）明顯升高（P < 0.05）。表明PAB能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1。

a b

c d

a：對(duì)照組；b：4 μmol/L土荊皮酸；c：8 μmol/L土荊皮酸；d：16 μmol/L土荊皮酸

圖1 土荊皮酸對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 PAB對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期數(shù)據(jù)顯示，PAB能抑制A549細(xì)胞的G1期行進(jìn)和G1/S轉(zhuǎn)換，S期細(xì)胞比例降低，表示PAB能夠阻滯細(xì)胞周期。見(jiàn)圖2。

2.4 土荊皮酸對(duì)A549細(xì)胞Caspase-3活性的影響

Caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果顯示，PAB（4、8、16 μmol/L）處理后，A549細(xì)胞Caspase-3相對(duì)活性較對(duì)照組（0 μmol/L）明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖3。

2.5 土荊皮酸對(duì)A549細(xì)胞PTEN、Akt、p-Akt表達(dá)的影響

PAB（4、8、16 μmol/L）作用A549細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)PTEN、Akt、p-Akt，如圖4所示，細(xì)胞PTEN表達(dá)增加，總的Akt表達(dá)量沒(méi)有變化，而p-Akt表達(dá)減少，呈濃度依賴性，灰度值分析顯示，PAB（4、8、16 μmol/L）與對(duì)照組（0 μmol/L）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。表明PAB能上調(diào)PTEN，抑制Akt磷酸化。

3討論

細(xì)胞凋亡機(jī)制在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中扮演著重要角色，是重要的生理調(diào)控機(jī)制[5]，細(xì)胞無(wú)限增殖及細(xì)胞凋亡相對(duì)或絕對(duì)數(shù)不足在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[6]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是抗腫瘤治療最有效的途徑之一，因此，針對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制的藥物，特別是天然化合物的研究已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAB對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴性，藥物濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，其發(fā)揮抗腫瘤作用效果亦越好。本研究還檢測(cè)了PAB處理A549細(xì)胞后細(xì)胞周期改變，結(jié)果顯示，PAB能阻滯A549細(xì)胞的G1期行進(jìn)和G1/S轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致S期細(xì)胞比例降低，提示PAB可能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖。此外，本研究進(jìn)一步探討了PAB對(duì)是否通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制細(xì)胞的增殖作用。結(jié)果顯示，PAB處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的升高而明顯升高。上述表明PAB能抑制肺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

關(guān)于細(xì)胞凋亡的途徑及信號(hào)通路，目前研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡途徑主要包括內(nèi)部線粒體途徑、外部死亡受體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。Caspase作為半胱氨酸蛋白酶類(lèi)，其家族在內(nèi)部線粒體凋亡途徑中起著重要作用，可特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵，是導(dǎo)致凋亡的直接效應(yīng)物。其中Caspase-3是效應(yīng)凋亡蛋白酶，其被切割活化后，細(xì)胞凋亡則進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)階段[7]。Caspase-3在起始凋亡蛋白酶切割激活活化后，可通過(guò)裂解細(xì)胞凋亡抑制蛋白、細(xì)胞DNA修復(fù)相關(guān)分子、細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等機(jī)制，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，PAB處理后，A549細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性顯著升高，提示PAB可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡。

本研究進(jìn)一步探討了PAB引起凋亡的機(jī)制。磷酸酶基因（phosphatase and tensin homologue deleted in chromosome，PTEN）是1997年發(fā)現(xiàn)并命名的一種具有雙重特異性磷酸酶活性抑癌基因，因其在多種進(jìn)展期腫瘤中均發(fā)生突變，又被稱為多發(fā)性進(jìn)展期腫瘤突變基因（mutated in multiple advanced cancer-1，MMAC-1）。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因在多種腫瘤細(xì)胞包括大腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、肺癌中突變，表達(dá)下調(diào)甚至缺失[8-11]。已經(jīng)證實(shí)，PTEN發(fā)揮抑癌作用主要依靠其磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子PI3P，進(jìn)而阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路，即PTEN-PI3K/AKT信號(hào)通路[12-13]。PTEN基因的失活導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路異?；罨惓；罨腁KT繼而產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)血管生成等多種生物學(xué)效應(yīng)[14]，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有極其重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，PAB處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞PTEN表達(dá)上調(diào)，同時(shí)，細(xì)胞總的Akt表達(dá)量沒(méi)有變化，而p-Akt表達(dá)減少，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明PAB能上調(diào)PTEN從而抑制Akt信號(hào)通路。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAB可抑制A549細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與PAB上調(diào)抑癌基因PTEN從而抑制Akt信號(hào)通路，繼而阻滯細(xì)胞周期并激活線粒體凋亡途徑相關(guān)。有關(guān)PAB的潛在抗腫瘤機(jī)制尚需進(jìn)一步深入探索和研究。

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（收稿日期：2014-10-14 本文編輯：任 念）