楊 珺，任軍方，姜殿強，王丹萍，云 勇

(海南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶園藝研究所，?？?71100)

兜蘭屬為多年生草本植物，是蘭科瀕危類群之一，海南卷萼兜蘭是海南特有的一種蘭花，其株型優(yōu)美、花朵艷麗、花期較長、具有極高的觀賞價值。目前，卷萼兜蘭的利用整體上仍處于直接從自然界獲取的低級階段，近年來，過度的采挖和環(huán)境的惡化使野生資源受到了嚴重破壞。卷萼兜蘭主要繁殖方式是分株繁殖，周期長、且易傷母株，造成卷萼兜蘭組培困難，無菌苗移栽成活率很低的原因是蘭根中沒有形成菌根結(jié)構(gòu)，不能為蘭花的生長提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)。組培苗菌根化是解決瀕危蘭花資源人工栽培的關(guān)鍵，因此，研究蘭花與其真菌的結(jié)構(gòu)，探討菌根真菌與蘭科植物之間的相互作用，可以更好地保護、開發(fā)和利用海南卷萼兜蘭種質(zhì)資源。該研究對海南卷萼兜蘭的菌根菌類進行了初步研究，為卷萼兜蘭菌根的深入研究提供參考。

1 卷萼兜蘭菌根真菌的分離

1.1 材料與方法

1.1.1 材料

供試植物：野生卷萼兜蘭植株采集于霸王嶺國家級自然保護區(qū)。

培養(yǎng)基及配方：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （PDA）：去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉20g、水 1 000ml、氯霉素50mg。

1.1.2 方法

分離方法主要參照郭順星等的關(guān)于菌根真菌的分離方法，并略做改進。取卷萼兜蘭植株新鮮營養(yǎng)根，清水洗凈，75%酒精消毒30s，NaClO溶液 （2%）消毒分別處理1～12min，無菌水沖洗干凈后置于PDA培養(yǎng)基上，以接種最后一次沖洗的無菌水作為空白對照，于25℃恒溫培養(yǎng)，根段長出菌絲后，挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)移至另一平板進行純化培養(yǎng)，篩選獲得純菌株后,做好編號記錄，轉(zhuǎn)移至斜面培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 結(jié)果與分析

在不同的 NaClO處理中,以 2%NaClO處理 4～6 min為宜，分離結(jié)果較為理想，配合以酒精處理時間維持30 s時,分離效果更為明顯。經(jīng)過多次分離純化后，共得到11種不同分類的真菌菌株，編號為J～01—J～11。

2 菌根真菌的鑒定

2.1 方法

2.1.1 菌落培養(yǎng)特征及形態(tài)學觀察

將篩選出的卷萼兜蘭菌株分別接種至PDA培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)，觀察各菌種的生長情況并記錄菌落特征，包括菌落形狀、大小、正反面顏色、質(zhì)地以及是否產(chǎn)生色素等情況，挑取長勢良好的菌絲經(jīng)染色后置于光學顯微鏡下觀察菌絲特征及產(chǎn)孢情況。

2.1.2 真菌生長速率的測定

用直徑0.5cm打孔器在菌絲生長旺盛的菌落邊緣打取菌片，接種于新配好的PDA培養(yǎng)基平板中心，每個菌株3次重復(fù)，25℃恒溫培養(yǎng)，隔1天觀察1次，測量并記錄菌落在垂直方向上的直徑，記錄各個菌落長滿整個培養(yǎng)皿的時間，制作菌株的生長速度曲線，其橫坐標和縱坐標分別為培養(yǎng)時間和菌落直徑，以菌落直徑 （cm）除以時間 （天）為真菌菌絲生長速率。

圖1 部分真菌菌株的顯微結(jié)構(gòu)

2.1.3 菌種鑒定

該試驗采用形態(tài)學方法對菌根真菌進行初步鑒定，即依據(jù)菌株菌落的培養(yǎng)特征、菌株顯微形態(tài)觀察及其生長速率的結(jié)果，并結(jié)合文獻資料綜合分析相關(guān)特征的異同，最后確定菌株的鑒定分類。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1 菌株培養(yǎng)特征及顯微結(jié)構(gòu)描述

（1）J～01生長速度快，菌落淺白色，長絨毛菌絲，質(zhì)地疏松，氣生菌絲分叉，邊緣整齊，生長1周后整個菌落墨綠色，菌絲有隔，多次分枝。

（2）J～02正面中間灰綠色，邊緣白色，菌絲短而緊密，表面不平坦，邊緣整齊，背面可見培養(yǎng)基開裂，菌絲有隔，重復(fù)多次分枝，排列不規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

（3）J～03菌落呈咖啡色與黃色相間，整個菌落突起，中心菌絲似雪花狀，氣生蓬松，反面墨綠色，邊緣白色，菌絲直角分枝，有隔。

（4）J～04菌落白色，扁平，菌絲短，呈棉狀，菌絲稀疏，培養(yǎng)1周形狀似搶靶心，反面中間橘紅色，有隔菌絲。

（5）J～05菌落棉絮狀，正面淺白色，氣生，疏松，邊緣整齊，背面黃色，培養(yǎng)幾天后菌落表面呈水質(zhì)狀，同心環(huán)圓，顏色不一，菌絲有隔，產(chǎn)生鐮刀狀的分生孢子。

（6）J～06菌落正反面中間呈橘紅色、邊緣米黃色，菌落扁平，菌絲緊密，邊緣菌絲呈絨毛狀，菌落邊緣不整齊，有隔菌絲，銳角分枝。

（7）J～07菌落扁平，菌絲棉絮狀，較緊密，正反面呈白色，邊緣整齊，菌絲有隔，產(chǎn)生大量鐮刀狀的分生孢子。

（8）J～08菌落正反面呈白色，平坦，菌絲較短，緊貼著培養(yǎng)基表面生長，邊緣整齊，菌絲銳角分枝。

（9）J～09菌落正反面中間呈黑色、邊緣白色，菌落表面平坦，菌絲較短，生長月10天后，菌落正面灰綠色，反面藍綠色，菌絲分枝，網(wǎng)狀排列。

（10）J～10菌落正反面呈白色，菌落平坦，形狀不規(guī)則，菌絲較短，菌絲有隔，樹枝狀分枝。

（11）J～11菌落正反面乳白色，細絨毛狀菌絲，菌絲稀疏，有隔菌絲，不規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)排列。

2.2.2 菌株的生長速率

真菌的生長速度是真菌的重要生物學特性之一，不同的菌株在相同的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，具有不同的生長速度，測定其生長速率，在真菌的分類鑒定上具有較為重要的意義。該次測定將分離出的11種菌株均接種至PDA培養(yǎng)基上，放置于相同的環(huán)境條件下進行培養(yǎng)， 以獲取不同菌株的生長速率，為真菌菌株的鑒定提供依據(jù)。菌株P(guān)DA培養(yǎng)基上生長速度詳見圖2和圖3。

圖2 部分菌根真菌在PDA培養(yǎng)基上生長速度曲線

圖3 部分菌根真菌在PDA培養(yǎng)基上生長速度曲線

圖4 部分菌根真菌在PDA培養(yǎng)基上生長速度曲線

從圖表中可以看出，除J～01菌株生長迅速與J～10菌株生長較為緩慢外，大多數(shù)菌株在10～18天內(nèi)均可長滿整個培養(yǎng)皿，表明不同的菌株間具有不同的生物學特性，并且各菌株在不同的生長階段里，其生長速度也不完全穩(wěn)定，這可能與菌種本身的生長機制和培養(yǎng)條件的差異性有關(guān)。

2.2.3 菌株形態(tài)初步鑒定

該次實驗主要以菌落的形態(tài)特征、菌絲、顯微結(jié)構(gòu)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為主要鑒定依據(jù)，對卷萼兜蘭菌根真菌進行了分類鑒定。對從卷萼兜蘭根中分離出來的11株真菌進行鑒定，初步得出下列結(jié)論：在11個供試菌株中，有兩個菌株鑒定結(jié)果待定，其余菌根只鑒定到屬，鑒定結(jié)果見表1。

表1 菌株鑒定結(jié)果

3 討論

表面消毒試劑及不同時長處理,對內(nèi)生真菌的分離也有很大影響。材料消毒措施的力度 (消毒劑的殺菌力、使用濃度、消毒時間等)越大,滅菌就越徹底,污染力越低。但是消毒劑對植物組織細胞都是有毒的,因此會造成組織細胞損傷嚴重，成活率也就越低。該試驗過程中，表面滅菌采用NaClO較HgCl2溶液的毒性小，且篩選獲得分離效果很好的消毒時間，因此該方法進行表面消毒適用于該材料。由于在相關(guān)文獻中報道在根基和根尖中存在的內(nèi)生真菌較少,所以在取材時也應(yīng)注意盡量選取根中部的材料做試驗。

分離得到菌根真菌的培養(yǎng)過程觀察發(fā)現(xiàn)，卷萼兜蘭內(nèi)生真菌不同種類的生長情況存在較大差異性。J～01僅3天可長滿整個培養(yǎng)皿，J～10則需26天才會長滿，這可能由真菌本身的生長特性或者這種菌的種群數(shù)量決定?？砷_展卷萼兜蘭的菌根真菌共生萌發(fā)和回接實驗，篩選其優(yōu)勢菌株，對菌根真菌代謝產(chǎn)物進行研究以便深入了解菌根真菌促進蘭科植物生長發(fā)育的生理生化機理，為兩者間專一性關(guān)系打下基礎(chǔ)。從卷萼兜蘭的根中分離并初步鑒定得到3個菌種屬于鐮刀菌屬，這與相關(guān)報道中鐮刀菌占優(yōu)勢一致，與其他蘭科植物的菌根特征一樣，該鐮刀屬真菌可能為卷萼兜蘭菌根的優(yōu)勢菌種。

蘭科菌根真菌的分類和鑒定目前還主要依靠形態(tài)學方法，該研究分離到的真菌只鑒定到屬而沒有鑒定到種，是因為蘭科植物菌根真菌的鑒定比較復(fù)雜，菌根的同源性較高。近年來，分子生物學技術(shù)得到了快速發(fā)展，很多菌物鑒定工作都引入了分子生物學鑒定方法。分子生物學能夠?qū)π螒B(tài)分類學起到客觀的評價作用，菌根真菌的研究也引入分子生物學的技術(shù)手段，傳統(tǒng)的形態(tài)學方法和分子手段相結(jié)合能將菌株鑒定到種，使鑒定結(jié)果更加準確可靠。