潘瑞玲，韓慧琴

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030； 2.河北省張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 張家口 075000）

四神片由煨肉豆蔻、鹽補(bǔ)骨脂、醋五味子、制吳茱萸、大棗（去核）和干姜6味中藥組方，《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》［1］中設(shè)置了吳茱萸的薄層色譜鑒別項(xiàng)，但未對(duì)其進(jìn)行定量檢驗(yàn)。國(guó)內(nèi)相繼有對(duì)吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內(nèi)酯含量測(cè)定的報(bào)道［2-6］，但未見(jiàn)用1種流動(dòng)相同時(shí)測(cè)定四神片中吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的報(bào)道。為此，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法（二極管陣列檢測(cè)器），利用1種流動(dòng)相，同時(shí)測(cè)定四神片中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，旨在為有效控制四神片的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Mettler AE163型電子天平（瑞士）；Shimadzu UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本）；Waters 2695-2996型高效液相色譜儀（美國(guó)）。吳茱萸堿對(duì)照品（供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110802-200606）；吳茱萸次堿對(duì)照品（供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110801-201006）；四神片（陜西永壽制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為120601，120806，120609）；陰性樣品（自制）；甲醇、乙腈為色譜純；十二烷基硫酸鈉、磷酸為分析純；水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［7］

色譜柱：Capcell PAK-C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（含十二烷基硫酸鈉0.2%）-甲醇-乙腈（50 ∶20 ∶30）；流速：1.0 mL ／min；吳茱萸堿檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm；吳茱萸次堿檢測(cè)波長(zhǎng)：343 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取吳茱萸堿對(duì)照品、吳茱萸次堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加無(wú)水乙醇制成每1 mL各含2.5 μg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。取供試品 10片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取 1.2 g（2片的質(zhì)量），精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入1%濃氨水無(wú)水乙醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液 10 mL，加入中性氧化鋁柱（120～150目，5 g，內(nèi)徑 1.5～2 cm，濕法裝柱）上，用無(wú)水乙醇10 mL洗脫，收集洗脫液，置25 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液［8］。按處方比例制備缺吳茱萸飲片的吳茱萸陰性四神片制劑，再按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性考察：取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定。結(jié)果對(duì)照品溶液色譜有較好的峰形，供試品溶液色譜中吳茱萸堿和吳茱萸次堿能與其他雜質(zhì)獲得較好分離，分離度大于1.5，其色譜峰的純度角度均小于純度閾值，且陰性無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密量取質(zhì)量濃度為0.003 75 g／L的吳茱萸堿和 0.002 5 g ／L 的吳茱萸次堿對(duì)照品溶液 1，2，5，10 μL，精密量取質(zhì)量濃度為0.075 g／L的吳茱萸堿和0.05 g／L的吳茱萸次堿對(duì)照品溶液 1，2，5，10 μL，分別注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品進(jìn)樣量（μg，X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得吳茱萸堿回歸方程 Y＝10 469 353X-2 857，r＝0.999 9；吳茱萸次堿回歸方程 Y ＝8 239 439 X-4 820,r＝0.999 9。結(jié)果表明，吳茱萸堿進(jìn)樣量在 0.003 8 ～0.750 0 μg、吳茱萸次堿進(jìn)樣量在0.002 5～0.500 0 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取供試品10片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取1.2 g（2片的質(zhì)量），精密稱(chēng)定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的峰面積。結(jié)果的 RSD分別為0.36%和0.62%（n＝5），表明儀器精密度良好。

圖1 吳茱萸堿高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)［9］：取同一供試品（批號(hào)為 120601）溶液，分別于0，8，12，16，20，24 h 按擬訂色譜條件各進(jìn)樣 10 μL 測(cè)定，記錄吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積積分值。結(jié)果的 RSD分別為0.68%和0.73%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批供試品（批號(hào)為120601）適量，研細(xì)，混勻，取 0.96，1.20，1.44 g 各 3 份，精密稱(chēng)定，按擬訂方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品中吳茱萸堿的平均含量為 74.58 μg／g，RSD 為 0.89% （n ＝9）；吳茱萸次堿的平均含量為 106.2 μg／g，RSD 為 0.96%（n ＝9）。

圖2 吳茱萸次堿高效液相色譜圖

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的四神片（批號(hào)為120601），研細(xì)，混勻，取6份，每份約0.6 g，精密稱(chēng)定，每2份為1組，分別用以1%濃氨水無(wú)水乙醇為溶劑制備的3種吳茱萸堿和吳茱萸次堿對(duì)照品混合溶液（質(zhì)量濃度分別為 1.432 μg／mL 和 2.039 μg／mL，1.788 μg ／mL 和 2.529 μg／mL；2.147 μg ／mL 和 3.058 μg ／mL）代替1%濃氨水無(wú)水乙醇，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 吳茱萸堿和吳茱萸次堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg／片，n＝2）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批四神片，按擬訂方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

2010年版《中國(guó)藥典（一部）》吳茱萸藥材含量測(cè)定項(xiàng)下的流動(dòng)相為乙腈-水-四氫呋喃 - 冰醋酸（41∶59∶1 ∶0.2）［10］。采用該流動(dòng)相時(shí)，四神片中吳茱萸堿和吳茱萸次堿色譜峰與其他雜質(zhì)峰重疊，反復(fù)調(diào)整比例仍無(wú)法達(dá)到基線(xiàn)分離。后采用0.1%磷酸溶液（含十二烷基硫酸鈉0.2%）-甲醇-乙腈為流動(dòng)相，通過(guò)調(diào)整比例為（50∶20∶30）后，得到分離度良好、出峰時(shí)間適宜的色譜圖。提取溶劑的考察曾采用環(huán)己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮作溶劑制備供試品溶液，均未使待測(cè)峰的分離得到改善，改用無(wú)水乙醇后試驗(yàn)結(jié)果良好。試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)超聲時(shí)間、所加溶劑的量、中性氧化鋁的量和洗脫液的量都進(jìn)行了考察，最后確定了文中的提取方法。

吳茱萸堿和吳茱萸次堿雖為生物堿，但不易溶于酸水中，因此，供試品溶液的前處理凈化不能采用酸水。

本方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，高效，并有較高的重復(fù)性，可作為四神片的質(zhì)量控制方法。

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