張英姿

（湖南省婦幼保健院藥劑科，湖南 長沙 410008）

蜂膠是蜜蜂從自然界長壽膠原植物新生幼芽或破損樹皮位置采集的樹脂類分泌物，混入其上顎腺、蠟腺、舌腺的分泌物，經(jīng)蜜蜂生化加工而成的具有芳香氣味的膠狀物質(zhì)，含有20大類380多種天然活性成分，其中包含30多種黃酮類物質(zhì)、數(shù)十種萜烯類物質(zhì)等具有生理活性的天然成分［1］。目前，我國基本上都采用食用酒精提取毛膠制得黑蜂膠的生產(chǎn)工藝，但產(chǎn)品含有部分多酚咖啡酸聚合物等黑色雜質(zhì)，顏色發(fā)黑，入口麻木；且由于生產(chǎn)過程中需要加熱濃縮回收，使蜂膠中的一些熱敏性成分如萜烯類等被氧化分解，造成產(chǎn)品功效成分不全，不能最大程度地發(fā)揮功效。日本、巴西等國常采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取蜂膠，產(chǎn)品具有天然黃色、成分全面和無鉛污染等諸多特點，但總黃酮含量較酒精提取蜂膠低，功效成分提取也不完全［2］?，F(xiàn)代研究已證實，酒精提取的黑蜂膠具有增強(qiáng)免疫力、保肝、降血糖等功能［3-6］，但黃蜂膠和黑蜂膠合用增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用的研究目前尚未見報道。本研究中采用的蜂膠先用超臨界CO2流體萃取得到黃蜂膠，對其提取后的蜂膠渣再用食用乙醇提取得到黑蜂膠，并研究了兩者合用對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥制備

蜂原膠預(yù)處理：將蜂原膠（毛膠）-20℃冷凍8 h，粉碎，篩得蜂原膠粉。

超臨界CO2萃取：HA121型超臨界流體萃取裝置（江蘇華安超臨界萃取有限公司），蜂原膠粉萃取壓力為30MPa，萃取溫度為55℃，萃取時間為4 h，原料與輔料的比例為3∶1，萃取流速為50 kg／h，分離溫度為30℃，得黃蜂膠。超臨界CO2萃取后，渣采用8倍95%食用乙醇攪拌18 h，120目過濾；-5℃冷凍，300目過濾除蠟，重復(fù)3次；在45～50℃減壓回收乙醇，濃縮相對密度不低于1.2（45℃），得浸膏；浸膏于-20℃冷凍8 h，粉碎過篩，即得黑蜂膠。

黃黑蜂膠：將大豆油加熱至45～50℃，分別加入全部黃蜂膠和黑蜂膠，攪拌。每人每天2 g，每天攝入黃黑蜂膠共0.56 g，大豆油 1.44 g。

1.2 試驗動物與分組

SPF級昆明種雌性小鼠160只，體重18～22 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2009-0012，均分為4組，各40只，分別對小鼠進(jìn)行NK細(xì)胞活性的影響、碳廓清試驗、臟體比值測定、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗、半數(shù)溶血值（HC50）測定和抗體生成細(xì)胞數(shù)測定，刀豆蛋白A（ConA）誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗。

1.3 試驗環(huán)境與給藥方法

試驗環(huán)境：溫度為23～24℃，相對濕度為50% ～56%，試驗動物使用許可證號為SYXK（湘）2010-0010。

劑量選擇及樣品處理：據(jù)人體口服推薦量每天2 g，含黃黑蜂膠0.56 g，加1.44 g大豆油混合。設(shè)黃黑蜂膠低劑量組（LD組）、中劑量組 （MD 組 ）、高劑量組 （HD 組 ），分別給予 0.167，0.333，1.000 g／（kg·bw），相當(dāng)于人體推薦劑量的 5，10，30 倍。分別取樣品 3.34，6.66，20.00 g，加大豆油定容至 200 mL，配成所需濃度受試液，對照組（C組）予以等體積的大豆油，分別給予受試動物灌胃，每日 1 次，灌胃體積為 0.1 mL ／（10 g·bw），連續(xù) 30 d。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

根據(jù)國家《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》（2003年版）進(jìn)行。試驗數(shù)據(jù)采用SAS軟件分析。

2 結(jié)果

經(jīng)口給予小鼠不同劑量的黃黑蜂膠30 d，MD組、HD組小鼠NK細(xì)胞活性與C組比較顯著提高（P＜0.05）；足跖腫脹度、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、抗體生成數(shù)、HC50均有增高趨勢，HD組增高更顯著（P＜0.05）；對小鼠免商器官／體重比值、單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力、巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力均無明顯影響（P＞0.05）。詳見表1。

表1 黃黑蜂膠對小鼠免疫功能指標(biāo)的影響（ ± s，n＝10）

表1 黃黑蜂膠對小鼠免疫功能指標(biāo)的影響（ ± s，n＝10）

注：與 C 組比較，*P ＜0.05。

指標(biāo)NK細(xì)胞活性（%）NK細(xì)胞活性平方根反正弦轉(zhuǎn)換值脾臟指數(shù)（%）胸腺指數(shù)（%）注射后24 h足跖腫脹度（mm）淋巴細(xì)胞增殖能力（OD差值）溶血空斑數(shù)（個／106脾細(xì)胞）半數(shù)溶血值（HC50）碳廓清吞噬指數(shù)雞紅細(xì)胞率（%）C組29.2 ±16.3 32.0 ±10.4 0.519 ±0.091 0.332 ±0.044 0.23 ±0.13 0.024 ±0.017 127±38 169.7 ±20.5 4.34 ±0.67 28.3 ±6.7 LD組37.3 ±12.8 37.4 ±7.6 0.521 ±0.101 0.343 ±0.045 0.28 ±0.12 0.031 ±0.015 134±34 177.7 ±21.4 4.58 ±0.81 30.5 ±9.3 MD組50.1 ±16.4*45.1 ±9.8*0.530 ±0.123 0.348 ±0.042 0.32 ±0.16 0.040 ±0.023 157±45 196.6 ±28.5*4.84 ±0.71 33.4 ±5.3 HD組53.1 ±17.1*47.0 ±10.5*0.544 ±0.112 0.351 ±0.035 0.44 ±0.18*0.054 ±0.026*176±35*190.6 ±18.4 5.05 ±0.94 35.6 ±9.2

3 討論

目前，日本、巴西等蜂膠強(qiáng)國常采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取蜂膠，這種蜂膠與前2個階段的蜂膠相比有明顯優(yōu)勢，具有天然黃色、成分全面和無鉛污染等諸多特點。超臨界蜂膠因提取時不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，比較純凈，不產(chǎn)生黑色雜質(zhì)，因而呈現(xiàn)出天然蜂膠本來的黃色。超臨界CO2萃取技術(shù)屬低溫?zé)o氧萃取，故蜂膠中黃酮類、萜烯類等活性成分被很好地保留了下來，成分全面，功效應(yīng)優(yōu)于單純醇提蜂膠制品［7-8］。同時，因CO2是中性分子，而鉛的絡(luò)合物為極性分子，兩者不相溶，故超臨界蜂膠屬于無鉛提取蜂膠。

乙醇提取簡單、方便、易于大規(guī)模生產(chǎn)，在我國普遍使用，蜂膠國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 24283-2009中就僅規(guī)定了蜂膠乙醇提取物的質(zhì)量要求。超臨界CO2萃取的黃蜂膠總黃酮含量在6%以上，乙醇提取的黑蜂膠總黃酮含量一般在18%以上。故將超臨界CO2萃取技術(shù)提取和乙醇提取相結(jié)合，提取的蜂膠總黃酮含量可達(dá)28%；同時還可保留不耐熱的功效成分，可最大限度保全蜂膠內(nèi)的活性成分，尤其是避免了單純乙醇提取技術(shù)所造成的萜烯類物質(zhì)損失問題［9-10］。

本研究結(jié)果表明，黃黑蜂膠合用具有增強(qiáng)免疫力的功效。經(jīng)口給予小鼠 0.167，0.333，0.450 g ／（kg·bw）劑量的黃黑蜂膠 30 d，0.450 g／（kg·bw）劑量能提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）能力、ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、血清、增加抗體生成細(xì)胞數(shù)（P＜ 0.05）。0.333 g ／（kg·bw）和 0.450 g ／（kg·bw）劑量的黃黑蜂膠能提高小鼠NK細(xì)胞活性（P＜0.05）。對小鼠胸腺體重比值、脾臟體重比值、單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力、小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力均無明顯影響（P＞0.05），據(jù)《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》中免疫調(diào)節(jié)作用的判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為黃黑蜂膠合用具有增強(qiáng)免疫力的功效。

大量研究表明，乙醇提取的黑蜂膠均有增強(qiáng)免疫力的功效［3-6］，超臨界CO2萃取技術(shù)提取的蜂膠和紫蘇子油合用具有免疫凋節(jié)作用。本研究中采用毛蜂膠，先經(jīng)超臨界CO2流體萃取得到黃蜂膠，其渣再用食用乙醇提取，得到黑蜂膠，此方法可最大限度地保全蜂膠內(nèi)的活性成分，提高總黃酮含量，二者混合食用能提高小鼠的免疫功能。但對于合用的量效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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