郝彥明，王洪震 ，賈正平 ，徐又佳，俞 晨

（1.江蘇省昆山市第一人民醫(yī)院關(guān)節(jié)科，江蘇 蘇州 215300； 2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，江蘇 蘇州 215004）

目前，甲基強(qiáng)的松龍（MPSS）是臨床治療急性神經(jīng)損傷相對有效的藥物，對損傷早期有一定效果，但不良反應(yīng)大、后期效果不佳。因此，對于現(xiàn)階段交通事故及墜落傷導(dǎo)致的高發(fā)疾病神經(jīng)損傷，迫切需要其他藥物以得到更好的救治效果。我科研組通過動物大體研究發(fā)現(xiàn)，促紅細(xì)胞生成素（EPO）對神經(jīng)系統(tǒng)損傷有明顯療效，其他學(xué)者同樣發(fā)現(xiàn)EPO用于神經(jīng)損傷早期及后期均能顯著降低繼發(fā)性炎性反應(yīng)及改善預(yù)后等。若將兩者聯(lián)合應(yīng)用，是否會得到更理想的效果，且以原代細(xì)胞為載體研究兩者聯(lián)合應(yīng)用對神經(jīng)細(xì)胞的作用目前尚未見報(bào)道。為此，筆者將MPSS與EPO聯(lián)用對星形膠質(zhì)細(xì)胞（AST）的作用進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

器械及儀器：眼科鑷，精細(xì)刀片，200目濾網(wǎng)，小燒杯，離心管，離心機(jī)；37℃恒溫?fù)u床，超凈工作臺，倒置顯微鏡，勻漿機(jī)，高速低溫離心機(jī)，分光光度儀，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀，F(xiàn)R-200型紫外與可見光分析裝置。

試藥與動物：DMEM／F12培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶，多聚賴氨酸（Sigma公司）；膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）熒光抗體（Sigma公司）；甲基強(qiáng)的松龍（MPSS，Pfizer Manufacturing Belgium NV公司，批號為H20080285）；促紅細(xì)胞生成素（EPO，日本麒麟啤酒株式會社高崎醫(yī)藥工廠，進(jìn)口藥品注冊證號J20060040）；磷酸鹽緩沖液（PBS，自行配制）。新生SD大鼠（蘇州大學(xué)動物中心提供，動物合格證號SCXK2008-0005）；GFAP引物、β-actin引物（生工生物工程＜上海＞股份有限公司）；PCR試劑（Promega公司）。

1.2 方法

星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)：將新生3 d內(nèi)的SD大鼠靜脈血釋放、處死，取出大腦（盡量完整），在預(yù)冷的PBS中剝離腦膜，并以PBS沖洗3遍（去血細(xì)胞及雜質(zhì)），將大腦切碎，吹打均勻，以1 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，再次吹打均勻，10 min后過濾，按1.5×107計(jì)數(shù)接種于培養(yǎng)瓶（需提前1 d用0.01%多聚賴氨酸包被），置培養(yǎng)箱（5%CO2，95%O2，37 ℃ ）中培養(yǎng)，3 d 后換液，8 ～10 d 細(xì)胞可分裂增殖滿瓶壁，放于搖床（200 r／min，18 h）去除少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，換液培養(yǎng)1 d后傳代，即得到純度較高的星形膠質(zhì)細(xì)胞，取培養(yǎng)至第3代、第4代的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

分組及處理：將試驗(yàn)用細(xì)胞分為8組，分別進(jìn)行如下處理。正常對照組（A1組）細(xì)胞傳代后培養(yǎng)2 d，棄去培養(yǎng)基，更換新培養(yǎng)基培養(yǎng)；正常細(xì)胞+MPSS組（A2組）細(xì)胞傳代后培養(yǎng)2 d，更換培養(yǎng)基，按 10 μmol／L 將 MPSS 加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)［1］；正常細(xì)胞+EPO組（A3組）細(xì)胞傳代后培養(yǎng)2 d，更換培養(yǎng)基，按10 U／L將EPO加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)［2］；正常細(xì)胞+MPSS+EPO組（A4組）細(xì)胞傳代后培養(yǎng)2 d，更換培養(yǎng)基，將 MPSS（10 μmol／L）與 EPO（10 U ／L）加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)；損傷組（B1組）細(xì)胞傳代后培養(yǎng)2 d，以PBS代替培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h，再換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)；損傷細(xì)胞+MPSS組（B2組）細(xì)胞傳代后培養(yǎng)2 d，以PBS 代替培養(yǎng)基培養(yǎng) 3 h，將 MPSS（10 μmol／L）加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)；損傷細(xì)胞+EPO組（B3組）細(xì)胞傳代后培養(yǎng)2 d，以PBS代替培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h，將EPO（10 U／L）加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)；損傷細(xì)胞+MPSS+EPO組（B4組）細(xì)胞傳代后培養(yǎng)2 d，以PBS代替培養(yǎng)基培養(yǎng) 3 h，將 MPSS（10 μmol／L）與 EPO（10 U ／L）加入并于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定：以GFAP鑒定，采用免疫熒光染色并鑒定。免疫熒光顯微鏡觀察可見較明顯的細(xì)胞形態(tài)，待星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)至第3代，細(xì)胞爬片3 d后用PBS洗3次（5 min）后，按熒光染色說明書染色、觀察并攝像。

MTT法檢測細(xì)胞活性：將傳代至第3代的細(xì)胞吹打均勻后，按照1×106／孔種植于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁，按照上述分組分別制造試驗(yàn)?zāi)Ｐ?；培養(yǎng)3 d后每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，然后每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振動器振蕩10 min；在酶聯(lián)免疫檢測儀上選用490 nm波長測定各孔吸光度值，記錄結(jié)果。

PCR法檢測GFAP的表達(dá)變化：將上述分組（共8組）細(xì)胞分別收集1×106，按PCR儀說明書操作步驟完成。GFAP和β-actin引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。將各組電泳條帶通過Smartview-2001生物電泳圖象分析軟件進(jìn)行吸光度分析，可得到試驗(yàn)組與對照組各時(shí)間點(diǎn)GFAP mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，各組樣本均數(shù)間比較行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下高純度的星形膠質(zhì)細(xì)胞

通過去纖維、血細(xì)胞、雜質(zhì)，搖床，分離傳代方式培養(yǎng)方法，可得到高純度（純度超過95%）的星形膠質(zhì)細(xì)胞，待傳代至第3代，細(xì)胞突觸明顯變長，相互間交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞純化度高，基本未見其他雜細(xì)胞（見圖1 A）。缺營養(yǎng)3 h后細(xì)胞形態(tài)已發(fā)生較明顯變化，如大部分細(xì)胞胞體變小，突觸變短，細(xì)胞間相互連接減少或消失，部分甚至呈空泡樣，個(gè)別細(xì)胞萎縮至呈圓形（見圖1 B）。

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞倒置顯微鏡圖

2.2 熒光免疫化學(xué)染色結(jié)果

因GFAP為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白，GFAP染色可使星形膠質(zhì)細(xì)胞呈陽性，可清晰顯示正常星形膠質(zhì)細(xì)胞：胞體多數(shù)為三角形，胞膜光滑，邊界清楚，突觸長并多數(shù)相互連接；DAPI熒光染色可清晰顯示細(xì)胞核，多為藍(lán)色圓形，GFAP陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例在95%以上（見圖2）。

圖2 星形膠質(zhì)細(xì)胞熒光免疫化學(xué)染色圖

2.3 MPSS與EPO對星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

結(jié)果見表2和表3?？梢?，B1組與A1組細(xì)胞活性有顯著性差異（P＜0.05），故該細(xì)胞損傷模型制作成功；MPSS與EPO聯(lián)用及兩者單用對缺營養(yǎng)損傷后細(xì)胞活性有顯著性影響（P＜0.05），單用MPSS、單用EPO與缺營養(yǎng)損傷后的細(xì)胞活性有顯著性差異（P＜0.05），但單用MPSS與單用EPO組間細(xì)胞活性則無顯著性差異（P＞0.05）；MPSS與EPO聯(lián)用及兩者單用對正常細(xì)胞活性無顯著性影響（P＞0.05），單用MPSS與單用EPO組間細(xì)胞活性也無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 各組細(xì)胞活性測定結(jié)果（吸光度值，MTT法）

表3 各組細(xì)胞活性測定結(jié)果比較

2.4 MPSS與EPO對星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響

結(jié)果見表4、表5及圖3?？梢?，各組細(xì)胞 GFAP mRNA表達(dá)水平比較，B1組與A1組有顯著性差異（P＜0.05），故該細(xì)胞損傷模型制作成功；B4組比 B1組、B2組、B3組明顯升高，B2組、B3組比B1組也明顯升高，而B2組與B3組間則無明顯差異；A4組比A1組、A2組及A3組均無明顯差異；A2組、A3組比A1組及A2組比A3組間也無明顯差異。

表4 各組細(xì)胞GFAP mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果（相對表達(dá)量，PCR法）

表5 各組細(xì)胞GFAP mRNA表達(dá)水平比較

圖3 各組細(xì)胞GFAP mRNA及βactin的電泳條帶

3 討論

原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)難度大，且細(xì)胞純化難度大，本研究中利用星形膠質(zhì)細(xì)胞在0.01%多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)皿貼附能力大于其他神經(jīng)細(xì)胞的原理純化得到星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過反復(fù)吹打洗滌可去除血細(xì)胞；腦膜表面的纖維細(xì)胞要得到良好去除，必須完整剝離腦膜，故選擇乳鼠，迅速完整取出大腦，在PBS內(nèi)適當(dāng)浸泡后腦膜與腦實(shí)質(zhì)可較容易分離。試驗(yàn)細(xì)胞純度鑒定采用GFAP。GFAP為特有細(xì)胞骨架蛋白，可作為星形膠質(zhì)細(xì)胞生理和病理情況下的特異性分子標(biāo)志，且可根據(jù)其表達(dá)評價(jià)細(xì)胞的損傷程度。已有研究發(fā)現(xiàn)，在維持星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能中，GFAP擔(dān)任重要作用，若阻滯GFAP的表達(dá)，細(xì)胞的生長、增殖均受到嚴(yán)重 影響 。Farooque 等［3］與 O′Brein 等［4］報(bào)道 ，在 急 性 脊 髓 損 傷（ASCI）模型大鼠可觀測到星形膠質(zhì)細(xì)胞體積變大，GFAP含量明顯增加。

糖皮質(zhì)激素對神經(jīng)系統(tǒng)的作用已有較多研究，但其對GFAP表達(dá)及合成的影響研究相對較少。O′Callaghan等［5］發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素能抑制未損傷大鼠腦組織海馬區(qū)內(nèi)GFAP的合成，卻不能影響損傷后GFAP合成的增加。EPO對神經(jīng)系統(tǒng)的作用為目前研究的熱點(diǎn)，鑒于神經(jīng)細(xì)胞損傷后除糖皮質(zhì)激素大量沖擊治療暫無明顯有效的藥物，但大量糖皮質(zhì)激素應(yīng)用后會產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，故許多學(xué)者開始研究新的藥物或聯(lián)合應(yīng)用的效果。Villa等［2］通過動物模型研究證明，外源性的重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）能有效地通過血腦屏障，并能提供神經(jīng)保護(hù)。俞歐［6］認(rèn)為，rhEPO不僅能糾正腎性貧血，還具有改善細(xì)胞營養(yǎng)狀態(tài)和抗炎作用，局部缺血可產(chǎn)生致炎因子、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6，應(yīng)用rhEPO后炎性因子及腫瘤壞死因子可減少50%以上。Sirén等［7］研究發(fā)現(xiàn)，EPO和EPO受體在損傷8～48 h的神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)水平明顯增加；且在損傷后12～24 h EPO受體上調(diào)，到損傷后8 d EPO免疫反應(yīng)性減少，但顯示為EPO陽性的神經(jīng)元數(shù)目未發(fā)生變化，并在損傷周圍區(qū)大量血管顯示強(qiáng)EPO受體陽性，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中可見中度的EPO和EPO受體免疫反應(yīng)性表達(dá)；損傷后14 d，雖然血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的EPO免疫反應(yīng)性極弱，但EPO受體陽性仍持續(xù)不變。上述研究可證明，在神經(jīng)細(xì)胞及組織中不僅有EPO及EPO受體表達(dá)，且在損傷后表達(dá)可明顯改變，為EPO應(yīng)用于損傷神經(jīng)細(xì)胞能夠產(chǎn)生藥物作用提供了理論依據(jù)。

EPO與MPSS聯(lián)合應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞已有學(xué)者進(jìn)行了研究，但存在不少爭議，這為進(jìn)一步的研究提供了思路及研究空間。Gorio等［8］的研究認(rèn)為，EPO不可與MPSS聯(lián)用，因?yàn)镸PSS有可能抑制EPO在脊髓損傷中的某些作用。Cetin等［9］的研究卻認(rèn)為，EPO聯(lián)合MPSS治療神經(jīng)損傷，能更好地提高神經(jīng)功能恢復(fù)并改善組織病理學(xué)形態(tài)。王望曉［10］對照研究了采用MPSS與鼠神經(jīng)生長因子對視神經(jīng)損傷的效果。

本研究中采用的劑量 MPSS 為 10μmol／L［1］，EPO 為 10U ／L［2］，結(jié)果顯示，MPSS與EPO聯(lián)用及兩者單用對缺營養(yǎng)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性有顯著性影響，單用MPSS、單用EPO對缺營養(yǎng)損傷后細(xì)胞活性也有顯著性影響，但單用MPSS與單用EPO組間細(xì)胞活性則無顯著性差異；MPSS與EPO聯(lián)用及兩者單用對正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞活性無顯著性影響，單用MPSS與單用EPO組間細(xì)胞活性也無顯著性差異。星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)或不表達(dá)或低表達(dá)MPSS受體與EPO受體，給予外源性MPSS或EPO時(shí)沒有相應(yīng)的受體可結(jié)合，不能激活相應(yīng)的信號通道。而損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞MPSS受體及EPO受體大量表達(dá)，外源性MPSS或EPO可分別與相應(yīng)的受體結(jié)合，其作用途徑需進(jìn)一步探討。MPSS與EPO聯(lián)用對缺營養(yǎng)損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞活性改善比兩者單用效果更好，進(jìn)一步推想，如要得到同樣療效，聯(lián)用時(shí)兩者的劑量是否會大大減少，從而可避免兩者的嚴(yán)重不良反應(yīng)，如高劑量MPSS引起的傷口感染、肺炎、敗血癥乃至死亡等呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥，MPSS的抗炎作用可能對神經(jīng)再生和軸突萌芽有不良反應(yīng)，從而加重?fù)p傷后神經(jīng)系統(tǒng)的缺血性壞死。

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