段春改，陳 鐘，李 菲，姜國(guó)志*，張巖巖

(1.河北省食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證審評(píng)中心，河北 石家莊 050091； 2.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430)

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HPLC-ELSD法測(cè)定芪黃通秘軟膠囊中黃芪甲苷含量

段春改1，陳 鐘2，李 菲2，姜國(guó)志2*，張巖巖2

(1.河北省食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證審評(píng)中心，河北 石家莊 050091； 2.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430)

目的：建立芪黃通秘軟膠囊中黃芪甲苷含量的測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法(HPLC-ELSD)，色譜柱為C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25)，流速為1.0mL·min-1，柱溫為35℃，漂移管溫度為105℃，載氣流速為2.0L·min-1。結(jié)果：該方法專屬性良好,黃芪甲苷線性范圍為1.832～5.496μg(r=0.999)，加樣回收率為99.70%，RSD為1.12%，耐用性良好。結(jié)論：該方法重現(xiàn)性好、靈敏、準(zhǔn)確，可作為芪黃通秘軟膠囊質(zhì)量的控制方法。

HPLC-ELSD；芪黃通秘軟膠囊；黃芪甲苷

芪黃通秘軟膠囊由黃芪、何首烏、當(dāng)歸、肉蓯蓉、黑芝麻等共十一味藥材組成，具有益氣養(yǎng)血、潤(rùn)腸通便的功效，用于功能性便秘辨證證屬“虛秘”者[1]，是神威藥業(yè)集團(tuán)獨(dú)家研制品種。方中黃芪為君藥，主要含皂苷類、黃酮類、多糖類及氨基酸類成分等，黃芪總皂苷(AST)具有免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝作用[2]，其中黃芪甲苷(AST-Ⅳ)為活性指標(biāo)成分，也是特征成分之一[3]。為了更好地控制本品的質(zhì)量，保證檢測(cè)黃芪甲苷含量的準(zhǔn)確性，確保臨床療效，本文建立HPLC-ELSD法測(cè)定芪黃通秘軟膠囊中黃芪甲苷含量的方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示該方法重現(xiàn)性好、靈敏、準(zhǔn)確，可作為芪黃通秘軟膠囊質(zhì)量的控制方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，Alltech 2000 ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110781-200613)；芪黃通秘軟膠囊(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)1306281)；甲醇(Fisher Scientific ，色譜純)，其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Thermo-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(75∶25)；流速：1.0mL·min-1；柱溫為35℃；ELSD的漂移管溫度：105℃，載氣流速：2.0L·min-1。

2.2 溶液制備和進(jìn)樣

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，用甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備[4]取本品內(nèi)容物5g，精密稱定，加硅藻土10g，研勻，置索氏提取器中，加乙醚適量，加熱回流提取4h，棄去乙醚液，提出濾紙筒，待乙醚揮盡，將濾紙筒再置于索氏提取器中，加甲醇足以沒過濾紙筒，冷浸過夜，再加甲醇適量，回流提取4h，回收甲醇并置水浴上蒸干。殘?jiān)铀?0mL使溶解，用水飽和的正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次30mL，棄去氫氧化鈉溶液，再以正丁醇飽和水洗滌至中性，正丁醇液置水浴上蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇使溶解，并轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按本品處方比例稱取除黃芪外的其余中藥適量，按照制劑工藝制成陰性對(duì)照制劑，照供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法專屬性考察

陰性空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL進(jìn)樣。在上述色譜條件下黃芪甲苷峰與其他峰達(dá)到基線分離，陰性空白溶液沒有干擾。見圖1。

圖1 高效液相色譜

2.4 線性試驗(yàn)

取0.3664mg/mL黃芪甲苷對(duì)照品溶液，依次精密吸取對(duì)照品溶液5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量的常用對(duì)數(shù)(X)為橫坐標(biāo)，峰面積的常用對(duì)數(shù)(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得黃芪甲苷線性回歸方程分別為Y=1.5193X+3.3984(r=0.999,n=5)。結(jié)果表明，黃芪甲苷含量在1.832～5.496μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 溶液穩(wěn)定性

按含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12h精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。測(cè)定結(jié)果表明，供試品溶液在室溫情況12h內(nèi)RSD為1.28%，溶液穩(wěn)定性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。測(cè)定結(jié)果RSD為0.88%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)同一樣品(批號(hào)1306281)6份，依含量測(cè)定項(xiàng)下供試品制備方法提取、制備、測(cè)定，結(jié)果表明，含量平均值為165.96μg/粒，RSD=0.93%，表明重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，稱取同一批已知含量的樣品(批號(hào)1306281)6份，精密加入等量黃芪甲苷對(duì)照品溶液(0.405mg/mL)，制備加樣回收供試品溶液，按照上述色譜條件檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，加樣回收率為99.7%，RSD為1.12%，方法準(zhǔn)確度高。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 耐用性

(1)不同柱溫考察。按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別于柱溫33℃、35℃、37℃精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，RSD為2.0%，結(jié)果表明，柱溫變化對(duì)樣品的測(cè)定影響不大。

(2)不同色譜柱考察。選用菲羅門-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)、華普-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)、島津-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)三個(gè)不同廠家的色譜柱測(cè)定峰面積。每根柱子平行測(cè)定2次。測(cè)定的結(jié)果RSD為0.86%。表明不同廠家C18柱(4.6mm×250mm,5μm)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小。

3 討論

3.1 方法選擇

黃芪甲苷在近紫外區(qū)200～210nm處有末端吸收，由于黃芪所含化學(xué)成分復(fù)雜，除黃芪甲苷外還有多種皂苷、氨基酸、多糖和黃酮類成分，這些成分大多數(shù)在波長(zhǎng)200nm附近存在吸收。直接采用紫外檢測(cè)器，干擾多，靈敏度低，準(zhǔn)確度差[5]。本實(shí)驗(yàn)參考黃芪注射液國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的黃芪甲苷檢測(cè)方法[6]，確定采用ELSD(蒸發(fā)光散射)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 提取方法確定

本實(shí)驗(yàn)采用黃芪甲苷易溶于甲醇、正丁醇的性質(zhì)，用甲醇浸泡回流提取，正丁醇萃取，乙醚除去油類雜質(zhì)，利用氫氧化鈉及水洗除去其他水溶性雜質(zhì)，得到較純凈的黃芪甲苷溶液。

3.3 HPLC-ELSD法優(yōu)勢(shì)

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中芪黃通秘軟膠囊中黃芪甲苷含量的測(cè)定采用薄層掃描法。該方法受薄層板鋪制、色譜展開條件、顯色劑配比及顯色條件等多因素的影響，重復(fù)性較差。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，有效規(guī)避了原薄層掃描法操作繁瑣、準(zhǔn)確度低、耗時(shí)過長(zhǎng)的缺點(diǎn)，為制訂芪黃通秘軟膠囊的標(biāo)準(zhǔn)提供了數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

本品含量測(cè)定方法經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，其專屬性、線性范圍、溶液穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、耐用性等均符合要求，該方法可以用于芪黃通秘軟膠囊中黃芪甲苷含量的測(cè)定。

[1] 張綱，陳浩達(dá)，孔德憲，等.芪黃通秘軟膠囊中三味藥材的薄層色譜鑒別[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(4):28-29.

[2] 黃可兒，趙敏，王建華．黃芪總苷的藥理研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理，2005，16(6)：461-463.

[3] 肖崇厚．中藥化學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1997：387-390.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京.化學(xué)工業(yè)出版社，2010:212.

[5] 田豐，鄧英杰.HPLC法測(cè)定黃芪中的黃芪甲苷含量[J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000,17(1)：17-22.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).黃芪注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2002,3(1)：32-34.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Determination of Astragaloside Ⅳ in Qihuangtongmi soft Capsules by HPLC-ELSD

Duan Chungai1，Chen Zhong2，Li Fei2，Jiang Guozhi2*，Zhang Yanyan2

(1.Hebei Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Certification，Shijiazhuang 050091， China；2.Shineway Pharmaceutical Group Co.,Ltd，Shijiazhuang 051430，China)

Objective:To establish an method for determing astragaloside Ⅳ in Qihuangtongmi soft capsules. Methods:The HPLC-ELSD method was conducted on a C18column (250mm×4.6mm，5μm) with methanol:water (75: 25) as mobile phase. The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min. The column temperature was at 35℃. The temperature of drift tube for measurement was 105℃ and the flow rate of air was 2.0 L·min-1. Results:The method is highly specific, the linear ranges of astragaloside Ⅳ was 1.832～5.496μg( r =0.999，n=5).The average recoveries of astragaloside Ⅳ were 99.70% with corresponding RSD of 1.12%. Conclusion:The method is sensitive, accurate with a good reproducibility and is reliable for quality control of Qihuangtongmi soft capsules.

HPLC-ELSD；Qihuangtongmi Soft Capsules；Astragaloside Ⅳ

2014-08-04

段春改(1969-)，女，河北省食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證審評(píng)中心高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量研究、技術(shù)審評(píng)及藥事管理。

姜國(guó)志(1981-)，男，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司工程師，研究方向?yàn)樗幤饭に嚒①|(zhì)量研究及產(chǎn)業(yè)化。

R284

A

1673-2197(2015)01-0023-02

10.11954/ytctyy.201501012