史洪君　劉琦　孟瀟等

摘要[目的] 研究測(cè)定灰棗cAMP含量的新方法及灰棗采收期對(duì)其cAMP含量的影響。[方法]以阿克蘇地區(qū)灰棗為研究對(duì)象，建立了HPLC法測(cè)定灰棗中cAMP含量的定量測(cè)定方法，并對(duì)不同采收時(shí)期的灰棗及其制干產(chǎn)品的cAMP含量進(jìn)行了測(cè)定。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，HPLC測(cè)定cAMP含量的色譜條件為：選用Inertsil ODS3色譜柱（4.6×250×5 μm）、以10%甲醇-90%的濃度為0.167 8%甲酸溶液為流動(dòng)相、柱溫30 ℃、流速 0.8 ml/min、檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm測(cè)定灰棗中的cAMP含量，cAMP濃度在1.0～100.0 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，R2=0.999 0，且其精密性高、重現(xiàn)性好、加標(biāo)回收率高（>98%， RSD值為1.38%）?；覘棽墒諘r(shí)期對(duì)鮮棗及其制干產(chǎn)品的cAMP含量有顯著影響（達(dá)到0.01顯著水平）。

[結(jié)論]阿克蘇地區(qū)灰棗在10月24日至10月31日期間采收，有利于保持較高的cAMP含量，此期采收的鮮灰棗及其干棗的cAMP含量分別為75.237和294.097 μg/g左右。 研究可為新疆阿克蘇地區(qū)紅棗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞灰棗；采收時(shí)間；環(huán)磷酸腺苷；HPLC

中圖分類號(hào)S665.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）16-291-03

Influence of Harvest Time of Huizao Jujube on Their Content of cAMP in Aksu Area

SHI Hongjun， LIU Qi， MENG Xiao， XIANG Yanju*

（College of Life Science， Tarim University/ Xinjiang Production & Construction Corp Key Laboratory for Advanced Processing of Local Agricultural Products in Southern Xinjiang， Alar， Xinjiang 843300）

Abstract[Objective] To develop new method for determination of cAMP content in Huizao jujube， and study effects of harvest time on cAMP content. [Method] With Huizao jujube in Aksu area as research object， the HPLC method was established for determination of cAMP content， cAMP content in Huizao jujube and its dried products in different harvest time was determined. [Result] The results as follows： the appropriate method with HPLC， were using Inertsil ODS3 column（4.6×250×5 μm）at 30 ℃ as stationary phase， using solution composed of methanol0.167 8% formic acid （10∶90）as mobile phase， detection wavelength at 254 nm， and flow rate with 0.8 ml/min. There was a good linear relationship between the concentration of cAMP and area integral value in the range of 1.0-100.0 μg/m， R2=0.999 0. The average recovery was over 98.0% with RSD=1.38. There was significant impact at 0.01 significant level between harvest time of Huizao jujube and their content of cAMP in fresh and dry fruits in Aksu Area.

[Conclusion] The appropriate harvest time was on between October 24 and 31 to obtain higher content of cAMP in Aksu Area， which was 75.237， 294.097 μg/g or so respectively. The study can provide scientific reference for Huizao jujube industrial development in Aksu Area.

Key wordsZizyphus jujube cv. Huizao； Harvest time； Adenosine cyclic 3，5monophosphate； HPLC

基金項(xiàng)目塔里木大學(xué)校長(zhǎng)基金（TDZKSS201421）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201410757013）。

灰棗（zizyphus jujube cv.huizao）質(zhì)地致密，可溶性固形物含量高（達(dá)30%），可食率97%以上，屬于優(yōu)質(zhì)的鮮食兼制干品種?；覘椬?0世紀(jì)70年代初從河南新鄭引種到新疆，已成為新疆發(fā)展紅棗產(chǎn)業(yè)的主導(dǎo)品種，也是阿克蘇地區(qū)紅棗主栽品種[1]。該區(qū)灰棗水分含量低，總糖含量高，含有豐富的VC、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）及必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[2]。灰棗中不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，更含有極為豐富的生物活性成分，cAMP 就是其中之一。臨床醫(yī)學(xué)研究證明，cAMP 能舒張平滑肌、擴(kuò)張血管、改善肝功能、激活蛋白，并對(duì)心肌梗塞、冠心病、心源性休克、牛皮癬等疾病有顯著療效[3]。棗中cAMP含量的檢測(cè)方法多是采用高效液相色譜法[4-6]。蒲云峰等用HPLC法測(cè)定了駿棗、冬棗、灰棗、葫蘆棗的cAMP含量，發(fā)現(xiàn)不同品種間cAMP含量差異較大，以灰棗含量最高，為（0.450±0.047）mg/g[7] 。而現(xiàn)有HPLC法測(cè)定cAMP含量時(shí)，使用的流動(dòng)相極大多數(shù)為甲醇和一定濃度的磷酸二氫鉀水溶液。

除鮮食棗在脆熟期采收外，晾制干棗的都要在完熟期采收[8]。陳德廷等研究發(fā)現(xiàn)，不同采收期對(duì)商品干棗的單果重、棗果等級(jí)、商品干棗的產(chǎn)量、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益影響極大[9]。史彥江等對(duì)環(huán)塔里木盆地的駿棗的適宜采收期進(jìn)行研究，結(jié)果表明，棗果干物質(zhì)積累隨采收期的延遲表現(xiàn)出先增加后停止的現(xiàn)象；其總糖含量和糖酸比，在10月5日時(shí)達(dá)最高值，其后呈降低趨勢(shì)，而總酸含量則隨采收期的延遲基本表現(xiàn)遞增的現(xiàn)象；不同地區(qū)的駿棗采收期有所不同，新疆于田縣試點(diǎn)及其相似區(qū)域，駿棗適宜采收期在10月15日左右，而新疆阿克蘇市、新和縣試點(diǎn)及其相似區(qū)域，適宜采收期宜則在10月20日左右[10]。

筆者以阿克蘇地區(qū)灰棗為研究對(duì)象，研究利用HPLC法測(cè)定灰棗cAMMP含量的新方法，并就灰棗采收期對(duì)其cAMP含量的影響進(jìn)行研究，以期為該地區(qū)紅棗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供科學(xué)參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試原材料。灰棗，采自塔里木大學(xué)校辦農(nóng)場(chǎng)4年生灰棗園。采收時(shí)期：自9月19日始，每隔6～7 d采果一次，至11月7日止，共采棗8次，采棗時(shí)間為18：00左右。采收方法：選健壯、豐產(chǎn)的棗樹(shù)20棵，在每株樹(shù)上分不同時(shí)期采收鮮棗，每次每株采40個(gè)棗果，采收時(shí)在所選的棗樹(shù)上打好標(biāo)記，并固定枝條作為采收枝。首次采收時(shí)，從枝條頂部第1個(gè)二次枝采摘，每間隔5～6個(gè)二次枝采摘1個(gè)二次枝上的所有棗果，依此類推。后期采摘樹(shù)上所標(biāo)枝條棗果不足時(shí)，從對(duì)應(yīng)枝樹(shù)下拾取不足部分。采后的棗及時(shí)置于4～5 ℃冷庫(kù)中預(yù)冷。

干制灰棗：按GBT 5835-2009 干制紅棗執(zhí)行。將采后經(jīng)預(yù)冷的灰棗于50 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥，至其水分含量在22%～25%時(shí)干燥終止。

1.1.2主要試劑。

cAMP標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%），Ruibio進(jìn)分，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；

甲醇（純度=99.9%），色譜純，SigmaAldrich；甲酸，分析純，天津市富寧精細(xì)化工有限公司；

娃哈哈飲用純凈水，石河子娃哈哈食品有限公司。

1.1.3主要儀器。

島津LC20A高效液相色譜儀，日本島津制作所；FA2104N電子天平，上海菁海儀器有限公司；KQ3200DV型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GL20GII 型超速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UPSⅢ10T優(yōu)惠超純水制造系統(tǒng)，成都超純水科技有設(shè)公司；GZX9420MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1紅棗cAMP提取樣液制備方法。

1.2.1.1鮮棗cAMP提取樣液制備方法。

準(zhǔn)確稱取鮮棗5 g，去皮去核后放入研缽研磨至勻漿，然后加入30 ml超純水將其全部轉(zhuǎn)移至三角瓶中，超聲提取30 min后，4 800 r/min離心30 min，取上清液。殘?jiān)貜?fù)提取一次（加入20 ml超純水），合并2次提取的上清液，移入容量瓶定容至50 ml，于4 ℃冰箱冷藏備用。將棗樣液過(guò)0.45 μm針式濾頭得使用液，注入樣品瓶中，4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.1.2干棗cAMP提取樣液制備方法。

準(zhǔn)確稱取鮮棗2 g，去皮去核后放入研缽研磨至勻漿，然后加60 ml超純水將其全部轉(zhuǎn)移至三角瓶中，超聲提取30 min后，4 800 r/min離心30 min，取上清液。殘?jiān)貜?fù)提取一次（加入40 ml超純水），合并2次提取的上清液，移入容量瓶定容至100 ml，于4 ℃冰箱冷藏備用。將棗樣液過(guò)0.45 μm針式濾頭得使用液，注入樣品瓶中，4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制。

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制。

準(zhǔn)確稱取0.012 9 g環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水定容至10 ml，得1.29 mg/ml的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

1.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)品使用液的配制。

精確吸取0.387 597 ml環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品貯備液于5 ml容量瓶中，用超純水定容至5 ml，得100 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液；再依次從制得的100、50、10、5、2 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液中吸取2.5、1.0、2.5、2.0、2.5 ml于5 ml容量瓶中并定容，制得50、10、5、2 和1.0 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液。濾液于4 ℃冰箱冷藏，用前過(guò)0.45 μm針式濾頭。

1.2.3色譜條件。

色譜柱：Inertsil ODS3，4.6×250×5 μm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 ml/min；波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μl；流動(dòng)相A：10%色譜甲醇，流動(dòng)相B：90%的濃度為0.167 8%的甲酸溶液（即將1 ml甲酸溶于一瓶容積為596 ml的娃哈哈純凈水）。

1.2.4方法測(cè)試。

按照上述色譜條件，將濃度為5、10 μg/ml的處理好的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液放入自動(dòng)進(jìn)樣器，掃描結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。從圖1～2可知，cAMP標(biāo)準(zhǔn)品在保留時(shí)間為14.445 min時(shí)有最大吸收峰出現(xiàn)，且該峰隨濃度增加，吸收峰高度及峰面積也增加，表明利用此法測(cè)定cAMP含量時(shí)其保留時(shí)間為14.445 min。

圖15 μg/ml cAMP標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜

圖210 μg/ml cAMP標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜

1.2.5棗中cAMP含量的計(jì)算公式。計(jì)算公式如下：

X=C×V/M

式中，X為待測(cè)紅棗樣品的cAMP含量（μg/g）；

C為 HPLC法測(cè)得的紅棗cAMP提取樣液中的cAMP濃度（μg/ml）；

V為制備紅棗cAMP提取樣液時(shí)定容的體積（ml）；

M為紅棗的質(zhì)量（g）。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別吸取10 μl cAMP 標(biāo)準(zhǔn)使用液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定其峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得圖3，并計(jì)算得回歸方程y=28 159x-19 592，R2=0.999 0。

圖3cAMP 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2精密性試驗(yàn)

將制備的紅棗樣品溶液過(guò)0.45 μm濾膜后放入樣品瓶中，準(zhǔn)確量取紅棗樣品溶液10 μl，用HPLC法測(cè)定其峰面積，從而確定cAMP含量。連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，結(jié)果見(jiàn)表1。計(jì)算得其RSD值為0.105 0%，表明該方法精密性良好。

表1精密度試驗(yàn)

試驗(yàn)號(hào)測(cè)提樣品液的峰面積樣液中cAMP含量∥μgcAMP含量平均值∥μgRSD%

1862 16831.3131.490.105 0

2866 98031.48

3868 43731.53

4869 59131.57

5868 84531.55

2.3重現(xiàn)性試驗(yàn)

將制備的紅棗樣品溶液貯藏于4 ℃冰箱中，6 d后取出，過(guò)0.45 μm濾膜后，分別量取1.5 ml置于5個(gè)樣品瓶中；再準(zhǔn)確量取紅棗樣品溶液10 μl，用HPLC法測(cè)定其峰面積，以確定cAMP含量，結(jié)果見(jiàn)表2。計(jì)算得其RSD值為1.78%，表明該方法重復(fù)性好。

表2重現(xiàn)性試驗(yàn)

試驗(yàn)號(hào)測(cè)提樣品液的峰面積樣液中cAMP含量∥μgcAMP含量平均值∥μgRSD%

1749 69927.3230.471.78

2874 49831.75

3854 06631.02

4858 00931.16

5856 87431.12

2.4回收率試驗(yàn)

將已經(jīng)測(cè)定了含量的紅棗樣品過(guò)0.45 μm的濾膜后，精密量取 1 ml置于5 個(gè)樣品瓶中，再加入濃度為10 μg/ml 的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1 ml，搖勻后，進(jìn)樣 10 μl，HPLC測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，用此色譜條件測(cè)定cAMP含量，其回收率超過(guò)98%，回收率RSD值為1.38%，表明該方法測(cè)定 cAMP含量時(shí)的回收率較好，方法可行。

表3加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)號(hào)樣液中cAMP含量∥μgcAMP加入量∥μgcAMP測(cè)定量∥μg回收率∥%平均回收率∥%RSD∥%

131.481041.2898.098.061.38

231.481041.3598.7

331.481041.2097.2

431.481041.1296.4

531.481041.48100

2.5采收期對(duì)灰棗及其干制品cAMP含量的影響

將樣品使用液按照“1.2.3”的色譜條件測(cè)定其含量，并按“1.2.5”中公式計(jì)算棗中的cAMP含量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4灰棗采收期對(duì)其cAMP含量的影響

由圖4可知，阿克蘇地區(qū)所產(chǎn)灰棗，自9月20日起至11月7日止，其鮮棗中cAMP含量在25.20～78.024 μg/g。在10月24日前隨著采收期的延遲，其含量逐漸升高，但在10月24日后其含量變化不大；而不同采收期的灰棗經(jīng)干制后，其含量先逐漸升高，到10月24達(dá)到最高值294.097 μg/g，隨后再逐漸降低。從不同采收期的鮮棗及制干后干棗的cAMP含量來(lái)看，阿克蘇地區(qū)灰棗以10月24日至10月31日期間采收，有利于保持較高的cAMP含量。

經(jīng)對(duì)采收時(shí)間、鮮棗的cAMP含量和干棗的cAMP含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，采收時(shí)間對(duì)鮮棗的cAMP含量和干棗的cAMP含量的影響，以及鮮棗的cAMP含量與干棗的cAMP含量之間都達(dá)到0.01極顯著相關(guān)水平。

表4采收時(shí)間、鮮棗的cAMP含量、干棗的cAMP含量三者間的相關(guān)性

項(xiàng)目采收時(shí)間鮮棗的cAMP含量干棗的cAMP含量

采收時(shí)間10.969**0.838**

鮮棗的cAMP含量0.969**10.931**

干棗的cAMP含量0.838**0.931**1

注：**表示在0.01水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)。

43卷16期

史洪君等采收期對(duì)阿克蘇地區(qū)灰棗cAMP含量的影響研究

3結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)，獲得了HPLC測(cè)定cAMP含量的色譜條件為：選用Inertsil ODS3色譜柱（4.6×250×5 μm）、以10%甲醇-90%的濃度為0.167 8%甲酸溶液為流動(dòng)相、柱溫30 ℃、流速 0.8 ml/min、檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm測(cè)定灰棗中的cAMP含量，cAMP濃度在1.0～100.0 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，R2=0.999 0，且其精密性高、重現(xiàn)性好及加標(biāo)回收率高（>98%，RSD值為1.38%）。

紅棗采收時(shí)期對(duì)鮮棗及制干后干棗的cAMP含量有顯著影響（達(dá)到0.01極顯著水平）；阿克蘇地區(qū)灰棗在10月24日至10月31日期間采收，有利于保持較高的cAMP含量，此期采收的鮮灰棗cAMP含量在75.237 μg/g左右，制得的干棗cAMP含量在294.097 μg/g左右。

參考文獻(xiàn)

[1] 牛攀新，袁火霞，楚光明.新疆南疆地區(qū)灰棗矮、密、早豐產(chǎn)栽培技術(shù)[J].北方園藝，2009（12）：155-157.