吳偉懷　梁艷瓊　鄭金龍　習(xí)金根　鄭肖蘭　李銳　劉巧蓮　張馳成　賀春萍　易克賢

摘 要 以寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg1～pppg5等5個基因cDNA序列為參考，設(shè)計基因編碼區(qū)特異性引物。利用5對引物分別對劍麻斑馬紋病菌進(jìn)行分子檢測以及基因同源克隆。通過此方法首次從劍麻斑馬紋病菌中獲得了5個多聚半乳糖醛酸酶基因，并分別命名為Szpg1～Szpg5。檢測結(jié)果表明，Szpg1～Szpg5基因普遍存在于被檢測劍麻斑馬紋病菌中。序列分析結(jié)果表明，Szpg1～Szpg5基因與pppg1～pppg5對應(yīng)基因之間存在核苷酸序列差異，由此導(dǎo)致個別氨基酸的差異，甚至提前終止。由此推測，Szpg1～Szpg5基因與pppg1～pppg5在功能上可能存在著一定的差異。

關(guān)鍵詞 劍麻斑馬紋??；多聚半乳糖醛酸酶；基因克隆

中圖分類號 S432.4；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Cloning and Sequence Analysis of Five Polygalacturonase

Genes of Phytophora nicotianae in Sisal

WU Weihuai1， LIANG Yanqiong1， ZHENG Jinlong1， XI Jingen1， ZHENG Xiaolan1，

LI Rui1， LIU Qiaolian2， ZHANG Chicheng3， HE Chunping1 *， YI Kexian1 *

1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control

of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests / Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical

Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

2 Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China

3 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan， 570228， China

Abstract Sisal zebra disease caused by Phytophora nicotianae var. parasitica is a kind of main diseases which cause serious damage to the sisal. In this study， five specific primer pairs were designed in coding region based on the reference sequence of pppg1 to pppg5 gene from Phytophora parasitica. Five specific primer pairs were used for the molecular detection and gene cloning from sisal zebra pathgoen DNA. This is the first time from sisal zebra isolating five polygalacturonase genes through this method， and respectively designated as Szpg1 to Szpg5. The detecting results showed that Szpg1 to Szpg5 genes were widely distributed in the sisal zebra isolates. Sequence analysis results showed that there were sequence differences between Szpg1 to Szpg5 and pppg1 to pppg5， respectively， leading to some amino acid differences， and even early termination. Thus it is speculated that Szpg1 to Szpg5 genes may exist a certain differences in function. This research would lay a solid foundation for the further study of sisal zebra germs polygalaturonase role in the pathogenic process.

Key words Sisal zebra disease； Polygalaturonase； Cloning

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.016

植物細(xì)胞壁是寄主與病原菌互作的重要場所，病原菌定殖于寄主表面后只有穿透細(xì)胞壁的屏障并與之建立了寄生關(guān)系，才能表現(xiàn)出致病性，在此過程中細(xì)胞壁降解酶發(fā)揮了極其重要的作用[1]。而由植物病原菌分泌的細(xì)胞壁降解酶主要包括多聚半乳糖醛酸酶（Polygalaturonase， PG）、果膠裂解酶、果膠甲基酯酶和β-半乳糖苷酶，其中PG在致病力和細(xì)胞壁降解酶中起著最為重要的作用[2]。已有研究結(jié)果表明，PG在植物病原菌侵染寄主過程中降解果膠，為病原菌順利與寄主建立寄生關(guān)系奠定基礎(chǔ)，是重要的致病因子之一。如當(dāng)黃曲霉菌（Aspergillus flavus）內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶基因pecA表達(dá)時，有利于病原菌在棉桃中的侵入與傳播[3]。BcPG1（Botrytis cinerea polygalacturonase 1）基因突變后能導(dǎo)致灰葡萄菌（Botrytis cinerea）對寄主植物的毒性減弱[4]。而侵染柑橘果實的鏈格孢菌（Alternaria citri）的內(nèi)切PG基因突變后在柑橘類與馬鈴薯組織中產(chǎn)生黑腐癥狀的能力明顯地減弱[5]。與之相似，由突變而產(chǎn)生的內(nèi)切PG基因活性喪失的麥角菌（Claviceps purpurea）突變菌株幾乎對黑麥不致病[6]。

由煙草疫霉（Phytophora nicotianae var. parasitica或Phytophora parasitica var. nicotianae）引起的劍麻斑馬紋?。⊿isal zebra disease）是一種嚴(yán)重危害劍麻的主要病害。如遇高溫多雨季節(jié)容易發(fā)生病害流行，造成植麻區(qū)麻田早期大量缺株，嚴(yán)重影響劍麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。該病曾于1973年在我國暴發(fā)并流行，成為劍麻生產(chǎn)影響最大的病害。雖然該病目前得到了有效控制，但是在高溫多雨季節(jié)仍可爆發(fā)成災(zāi)。前期，國內(nèi)外對于劍麻斑馬紋病菌的研究主要集中在該菌的致病性分化、生物學(xué)特性以及防治藥劑等研究方面，而沒有從PG這個關(guān)鍵的致病酶著手的研究報道。目前，已從寄生疫霉菌（Phytophora parasitica）中克隆了pppg1～pppg10共10個PG基因[7-8]。這為研究劍麻斑馬紋病菌中的PG基因提供了方便。為此，本研究以這些基因序列為參考序列設(shè)計基因特異引物，對劍麻斑馬紋病菌中PG基因進(jìn)行了克?。麨镾zpg）與測序；為下一步研究劍麻斑馬紋病菌PG對劍麻致病過程中的作用奠定基礎(chǔ)。本研究中即報道了Szpg1～Szpg5等5個基因的克隆與序列分析工作。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究中用于分子檢測的12個劍麻斑馬紋病菌分別收集自廣東、廣西、海南等劍麻種植區(qū)。其中廣東菌株8個，廣西菌株2個，海南菌株2個。菌株現(xiàn)保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所。其具體相關(guān)信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體收集及DNA提取 利用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基對各供試菌株進(jìn)行搖菌，28 ℃，160 r/min培養(yǎng)6 d 后，對菌絲體進(jìn)行收集。收集的各菌絲體迅速于液氮中研磨，后進(jìn)行基因組DNA提取。DNA提取采用DNA提取試劑盒（E.Z.N.A Fungal DNA kit， Omega公司，美國）提取，具體實驗步驟參考其說明書進(jìn)行。

1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成 在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)劍麻斑馬紋病原菌菌株6 d后，收集菌絲體并立即進(jìn)行總RNA提取?？俁NA 抽提按TRIzol試劑盒（Gibco-BRL）操作方法進(jìn)行。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperscriptTM III Reverse Transcriptase （Invitrogen）進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成。

1.2.3 引物設(shè)計 以寄生疫霉PG基因pppg1（AY697926）、pppg2（EU041943）、pppg3（EU041944）、pppg4（EU041945）、pppg5（EU041945）為參考序列[7-8]，利用軟件primer5.0于各基因啟始密碼子位置設(shè)計正向引物，而于終止密碼子處設(shè)計反向引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物包含完整的編碼區(qū)。用于對gDNA與cDNA的擴(kuò)增與克隆。設(shè)計引物參考下列原則：引物一般要求GC含量40%～65%，Tm值55～65 ℃，引物序列長18～25 bp，且無錯配、不形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。設(shè)計好的引物委托英駿生物技術(shù)有限公司合成。具體引物序列見表2。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件 基因組PCR反應(yīng)體系為20 μL，含有20～30 ng DNA模板，10 μL 2×EcoTaq PCR SuperMix，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），最后以ddH2O補齊。PCR反應(yīng)在 Mastercycler gradient Mastercycler PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；隨后94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，20 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，紫外燈下照相并保存。cDNA PCR擴(kuò)增參照基因組體系及條件，擴(kuò)增所使用的高保真酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2.5 克隆與序列分析 以菌株ND-12 DNA為模板，分別回收各基因的gDNA與cDNA擴(kuò)增子，各取4 μL與pEASYTM Cloning Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，各選取3個陽性克隆送英駿生物技術(shù)有限公司測序。獲得的序列經(jīng)人工去除載體序列后，利用DNAStar software（www.DNAStar.com）進(jìn)行序列拼接與相關(guān)分析。蛋白質(zhì)序列相似性分析利用http：//www.uniprot.org/uniprot/？query網(wǎng)站完成；蛋白質(zhì)的理論等電點（Theoretical isoelectric points， pI）和分子量（molecular weights， Mw）計算利用Compute pI/ Mw工具（www.expasy.ch/tools/pi_tool.html[9]）進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Szpg1～Szpg5基因分子檢測

利用所設(shè)計的5個基因特異引物對，分別以劍麻斑馬紋病菌菌株DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果5對引物分別從12個供試菌株中均擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。具體而言，引物pppg1F/R從12個菌株中均擴(kuò)增出特異條帶，其大小位于1～2 kb之間（圖1-A）；引物pppg2F/R和pppg3F/R也均從12個模板中擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，大小均與預(yù)期比較相似，約為1.1 kb（圖1-B；Szpg2基因分子檢測圖未列出）；而引物pppg4F/R和引物pppg5F/R從12個供試菌株中擴(kuò)增出1條比1 kb大的單一條帶（圖1-D）。由此表明，Szpg1～Szpg5基因在12個劍麻斑馬紋病菌菌中是普遍存在的。

2.2 Szpg1～Szpg5基因編碼區(qū)分析

利用5對引物分別擴(kuò)增菌株ND-12的gDNA與cDNA。結(jié)果表明，5對引物均從cDNA與gDNA中擴(kuò)增出條帶，而且來自cDNA的與其對應(yīng)gDNA的擴(kuò)增子大小無明顯差異（圖2）。

2.3 Szpg1～Szpg5基因編碼區(qū)序列分析及分子特征

對獲得的各基因的cDNA序列與相應(yīng)基因組序列作比較。序列分析結(jié)果表明，通過引物pppg1F/R獲得了1 227 bp的序列，含有348、828 bp等2個外顯子以及1個51 bp的內(nèi)含子。ORF Finder 軟件分析發(fā)現(xiàn)，完整ORF為1 176 bp，命名為Szpg1（依次類推）。推斷基因產(chǎn)物由391個氨基酸殘基組成，估計分子量為4.17 ku，等電點（pI）為5.57。與寄生疫霉PG基因pppg1的序列相比，Szpg1基因在編碼區(qū)存在3個核苷酸差異，其中一個為非同義突變（圖3-A），其氨基酸序列一致性水平為99%。

通過引物pppg2F/R獲得了Szpg2基因1 155 bp序列，預(yù)測為1個連續(xù)完整的ORF，編碼384個氨基酸，估計分子量為3.99 ku，等電點（pI）為9.17。與pppg2的序列相比，Szpg2基因編碼區(qū)存在30多個核苷酸差異，最終導(dǎo)致24個氨基酸的差異，其氨基酸序列一致性水平為93%（圖3-B）。

利用引物pppg3F/R獲得了Szpg3 1 155 bp的基因序列，ORF Finder 軟件分析發(fā)現(xiàn)為1個連續(xù)完整的ORF，編碼384個氨基酸，估計分子量為3.98 ku，等電點（pI）為9.25。與pppg3的序列相比，Szpg3在編碼區(qū)存在18個核苷酸差異，以及12個核苷酸插入。最終導(dǎo)致14個氨基酸的差異（圖3-C），其氨基酸序列一致性水平為96%。

通過引物pppg4F/R獲得了1 089 bp的Szpg4基因序列，為1個連續(xù)完整的ORF，編碼362個氨基酸，估計分子量為3.73 ku，等電點（pI）為6.71。與pppg4的序列相比存在5個核苷酸差異，其中1個為非同義突變（圖3-D），其氨基酸序列一致性水平為99%。

通過引物pppg5F/R獲得了Szpg5基因1 083 bp的序列， 與pppg5的序列相比，Szpg5其核苷酸序列存在7個核苷酸的差異。值得一提的是，在第73位的核苷酸的突變（C73T），與第74及75位核苷酸AA，形成了一個終止子，導(dǎo)致提前終止。由此推測，該基因并不具有正常功能（數(shù)據(jù)未列出）。

總之，來自劍麻斑馬紋病菌Szpg1至Szpg5基因中，除Szpg1中含有1個51 bp的內(nèi)含子外，其余基因并無內(nèi)含子。其編碼區(qū)序列與寄生疫霉PG基因pppg1～pppg5對應(yīng)基因之間存在核苷酸差異，尤其是Szpg2與Szpg3基因。此外，Szpg5基因由于單核苷酸的突變從而導(dǎo)致提前終止。

3 討論與結(jié)論

近年來，國際上有關(guān)卵菌PG基因族的研究已有一些報道。目前，研究卵菌多聚半乳糖醛酸酶基因比較多的是樟疫霉（P. cinnamomi）與致病疫霉（P. infestans）和寄生疫霉（P. parasitica）。對于卵菌的第一個內(nèi)切PG基因pipg1則是從馬鈴薯晚疫病菌致病疫霉分離到的，該基因編碼的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶具有致病活性[10]。此外，對樟疫霉（Phytophthora cinnamomi）致病菌PG基因家族的研究，發(fā)現(xiàn)受試致病性菌的PG基因家族組成較大，含有19個pg基因（Pcpg1～Pcpg19），其中除Pcpg5、Pcpg18、Pcpg13等3個基因外，其余的多個基因間具有明顯的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵pg基因編碼的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)基團(tuán)的修飾特性與PG致病活性密切相關(guān)[11]。而鞏振輝等[12-14]又對其若干個pg基因的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)pg基因均能指導(dǎo)合成相應(yīng)的PG酶，并具有不同的活性。并同時發(fā)現(xiàn)其中編碼該酶的具有不同程度糖基化的pg基因?qū)υ撁傅闹虏⌒云鹬陵P(guān)重要的作用。與之相似，寄生疫霉內(nèi)切PG基因事實上是一個多基因家系，除了pppg1之外[7]，至少還包含pppg2～pppg10等9個基因[8]。

盡管目前已從多種病原菌中分離到了多聚半乳糖醛酸酶基因，但在劍麻斑馬紋病菌中分離還未見報道。本研究利用同源克隆法首次對劍麻斑馬紋病菌中細(xì)胞壁降解霉基因Szpg1～Szpg5的編碼區(qū)進(jìn)行了分子檢測以及克隆及序列比較分析。通過本實驗表明它們在劍麻斑馬紋病菌中普遍存在，除Szpg5基因由于變異而提前終止外，其余Szpg1～Szpg4基因與寄生疫霉pppg1～pppg4對應(yīng)基因序列具有高度的相似性，其氨基酸序列一致性均在90%以上。除此之外，基因之間也存在不少核苷酸變異，甚至有些是非同義突變，究其原因可能是病原菌為適應(yīng)不同寄主、環(huán)境而進(jìn)化的結(jié)果。事實上，在基因與寄主之間的共進(jìn)化中，病原菌在面對寄主強(qiáng)大的選擇壓時，導(dǎo)致了病原包括基因點突變、基因缺失等多種變異[15-16]。

根據(jù)已有的表達(dá)實驗表明，寄生疫霉基pppg2能導(dǎo)致本生煙明顯的黃花與矮??；pppg4基因本生煙上產(chǎn)生矮化表型；而pppg5基因使本生煙產(chǎn)生銀葉以及葉肉細(xì)胞嚴(yán)重變形[8]。在氨基酸水平上，來自劍麻斑馬紋病菌Szpg1～Szpg4（Szpg5提前終止）與寄生疫霉基因pppg1～pppg4之間在存在一些差異。這些氨基酸的差異，是否導(dǎo)致功能上的變化還有待進(jìn)一步研究。

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