趙振鵬　楊振　林偉東　秦愛(ài)建　金文杰

摘要 [目的] 分析江蘇省豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的流行和變異情況。[方法] 采用RT-PCR方法對(duì)2013年3月至2014年12月從江蘇省9個(gè)不同地區(qū)采集的174份病料進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，并對(duì)來(lái)自不同地區(qū)9株病毒的部分M基因進(jìn)行克隆、測(cè)序和分析。[結(jié)果] 江蘇省PEDV的個(gè)體陽(yáng)性率為17.92%，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為61.54%；與經(jīng)典病毒株CV777相比，9株病毒的核苷酸序列和氨基酸序列都有突變。同源性分析表明，江蘇省內(nèi)PEDV毒株的核苷酸同源性為97.8%～100.0%，但與歐洲毒株的同源性較低；遺傳進(jìn)化分析表明，江蘇省PEDV流行株和參考株可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個(gè)群，7株江蘇省毒株和一些其他國(guó)內(nèi)毒株、泰國(guó)毒株、韓國(guó)毒株以及美國(guó)毒株屬于Ⅰ群，而另外2株江蘇株與2株泰國(guó)株構(gòu)成了Ⅲ群，而現(xiàn)用疫苗株CV777則屬于Ⅱ群。[結(jié)論]江蘇省內(nèi)PEDV有一定程度的進(jìn)化和變異，并且需要選擇更有效的疫苗株來(lái)控制PEDV的流行。

關(guān)鍵詞 豬流行性腹瀉病毒；江蘇??；流行病學(xué)調(diào)查；M基因；遺傳變異

中圖分類號(hào) S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）19-125-03

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea， PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）引起的以水樣腹瀉、嘔吐、脫水為主要癥狀的豬腹瀉性疾病[1]，該病最先在英國(guó)發(fā)現(xiàn)[2]，歐洲和亞洲是主要的流行區(qū)域[3-6]，但近年來(lái)該病在美國(guó)大規(guī)模爆發(fā)[7-9]，我國(guó)在1980年就有該病發(fā)生的相關(guān)報(bào)道，自2010年以來(lái)我國(guó)又爆發(fā)了大規(guī)模的PED[10-14]，各個(gè)年齡段豬均發(fā)病，仔豬致死率極高，且全季節(jié)都可發(fā)病，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科（Coronavirinae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus），其基因全長(zhǎng)約28 kb，包括5端非翻譯區(qū)、3端非翻譯區(qū)和至少7個(gè)開(kāi)放閱讀框（5-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3），主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白（纖突蛋白S、膜蛋白M、核衣殼蛋白N、小膜蛋白E）以及2種非結(jié)構(gòu)復(fù)制多聚酶（復(fù)制酶1a和1b）和1種非結(jié)構(gòu)輔助蛋白[15]。其中，M基因特別保守，它的突變更能體現(xiàn)病毒的變異情況，通常用來(lái)作為檢測(cè)病毒的靶基因。筆者運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)江蘇省13個(gè)豬場(chǎng)174份豬腹瀉糞便或腸組織病料進(jìn)行PEDV病原調(diào)查，并通過(guò)分析PEDV的部分M基因序列來(lái)了解PEDV在江蘇省的分布情況和變異情況，旨在為該病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料來(lái)源 2013年3月至2014年12月從江蘇省揚(yáng)州、南通、常州、泰州、宿遷、鹽城、大豐、濱海、連云港9個(gè)地區(qū)采集174份小腸內(nèi)容物或肛拭樣品，所有樣品均來(lái)自有明顯腹瀉的仔豬。

1.2 主要試劑 pGEM-T Easy載體和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；TRIzol試劑和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒均為Axygen公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)豬流行性腹瀉標(biāo)準(zhǔn)株CV777 M區(qū)部分基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為370 bp。上游引物為：5′-GGACACATTCTTGGTGGTCT-3′；下游引物為5′-GTTTAGACTAAATGAAGCA-3′。

1.4 樣品處理和目的片段的克隆測(cè)序 將采回的病料用PBS緩沖液按1∶5稀釋后凍融2次，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清300 μl按照TRIzol說(shuō)明書(shū)提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 1 min，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，克隆于pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，將含有鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒的菌液送交Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 序列分析 分別從各個(gè)地區(qū)隨機(jī)選出1或2毒株，依據(jù)采樣的地點(diǎn)和時(shí)間序列分別命名為JSBH140210、JSCZ130818、JSDF131228、JSNT131122、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127、JSYZ131228，使用DNAStar軟件對(duì)此9株P(guān)EDV 部分M基因及GenBankK 16株參考病毒株（表1）進(jìn)行核苷酸序列分析，并使用MEGA 5軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的RT-PCR擴(kuò)增 從病料中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板進(jìn)行M基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用12 g/L的瓊脂糖電泳凝膠檢測(cè)。從圖1可以看出，目的片段約為370 bp。

2.2 PEDV的陽(yáng)性率 由表2可知，PEDV在江蘇地區(qū)有較高的流行率，豬場(chǎng)PEDV平均陽(yáng)性率為61.54%，而有些地方豬場(chǎng)仔豬感染率達(dá)100%。

2.3 目的基因序列分析 M基因的核苷酸序列分析表明，與參考株CV777相比9株江蘇不同地區(qū)的PEDV都有若干點(diǎn)突變。其中，9株江蘇分離株在35位核苷酸由T突變?yōu)锳，在305位核苷酸由T突變?yōu)镃。另外，JSBH140210、JSCZ130818、JSNT131122、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127和JSYZ131228等分離株在290位核苷酸由A突變?yōu)镃，在327位核苷酸由G突變?yōu)門(mén)。與參考株CV777相比，推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明JSDF131228、JSNT131122在第87位氨基酸由G突變?yōu)镾，JSBH140210、JSCZ130818、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127和JSYZ131228等7株在109位氨基酸由A突變?yōu)镾。使用DNAStar和MEGA.4繪制9株分離株的M基因序列和參考序列之間的核苷酸相似度和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2～3）。

3 討論

自2010年以來(lái)，PEDV在我國(guó)豬場(chǎng)感染嚴(yán)重，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，江蘇省的仔豬腹瀉情況也比較嚴(yán)重，但相關(guān)的分子流行病學(xué)調(diào)查卻少見(jiàn)報(bào)道。筆者采用RT-PCR方法對(duì)江蘇省9個(gè)地區(qū)進(jìn)行PEDV病原調(diào)查，結(jié)果表明13個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)有8個(gè)豬場(chǎng)感染，感染率達(dá)61.54%；174份病料中陽(yáng)性病料31份，陽(yáng)性率達(dá)17.92%；有些豬場(chǎng)腹瀉仔豬PEDV感染陽(yáng)性率更高達(dá)100.00%，表明PEDV在江蘇省豬場(chǎng)中普遍存在，必須引起高度重視。

對(duì)不同地區(qū)的9株P(guān)EDV M基因的核苷酸序列分析，與參考株CV777相比9株江蘇分離株在35位核苷酸由T突變?yōu)锳，但與中國(guó)株（HNBF、HNQX）、韓國(guó)株（KPEDV-9、M2227、PFF188）、泰國(guó)株（08RB03）和美國(guó)株（USA/Colorado/2013）相同；在305位核苷酸由T突變?yōu)镃，但與中國(guó)株（LJB-03、DX-M、HNBF、HNQX）、韓國(guó)株（Chinju99、KPEDV-9、M2227、PFF188）、泰國(guó)株（M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95、08RB03）、美國(guó)株（USA/Colorado/2013）等株相同；JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119在第8位核苷酸位點(diǎn)由C突變?yōu)門(mén)；JSBH140210、JSCZ130818、JSNT131122、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127、JSYZ131228等8株在290位核苷酸由A突變?yōu)镃，與中國(guó)株（HNBF、HNQX）、泰國(guó)株（M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95、08RB03）、韓國(guó)株（PFF188）、美國(guó)株（USA/Colorado/2013）相同，在327位核苷酸由G突變?yōu)門(mén)，但與中國(guó)株（DX-M、HNBF、HNQX）、泰國(guó)株（08RB03）、韓國(guó)株（PFF188）、美國(guó)株（USA/Colorado/2013）株相同。與參考株CV777相比，推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明JSDF131228、JSNT131122在第87位氨基酸由G突變?yōu)镾，JSBH140210、JSCZ130818、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127、JSYZ131228等7株在109位氨基酸由A突變?yōu)镾，但與中國(guó)株（DX-M、HNBF、HNQX、BJ201O）、泰國(guó)株（08RB03）、韓國(guó)株（ PFF188）、美國(guó)株（USA/Colorado/2013）相同，這些突變表明江蘇省內(nèi)流行的PEDV并不完全相同，但突變位點(diǎn)與我國(guó)其他地區(qū)、韓國(guó)、泰國(guó)等周?chē)鷩?guó)家以及美國(guó)暴發(fā)的PEDV有很高的相似性，與歐洲株P(guān)EDV相似性不高。這些核苷酸和氨基酸位點(diǎn)的突變能否引起其抗原性的改變還需要進(jìn)一步研究。

對(duì)目的基因的同源性分析表明，江蘇省內(nèi)PEDV的同源性為97.8%～100.0%，與國(guó)內(nèi)其他分離株的同源性為97.0%～99.7%，與韓國(guó)分離株同源性為96.5%～100.0%，與泰國(guó)分離株同源性為96.7%～99.5%，與歐洲分離株的同源性為97.8%～98.9%，而與美國(guó)新分離株的同源性高達(dá)98.6%～100.0%，我國(guó)自2010年以來(lái)爆發(fā)的PEDV疫情與美國(guó)近年來(lái)暴發(fā)的疫情之間是否有關(guān)聯(lián)，也需進(jìn)一步研究。

基于PEDV目的基因建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可將PEDV分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3個(gè)群，Ⅰ群包括JSBH140210、JSCZ130818、JSSQ131229-1、JSSQ131229-2、JSTZ131119、JSYC131127、JSYZ131228和其他中國(guó)株（BJ2010、HNBF、HNQX、LJB-03）、韓國(guó)株（PFF188、 M2227）、泰國(guó)株（08RB03）、美國(guó)株（USA/Colorado/2013）；Ⅱ群包括中國(guó)株（DX-M、LZC）、韓國(guó)株（Chinju99、KPEDV-9）、英國(guó)株（Br1/87）以及比利時(shí)經(jīng)典參考株（CV777）；JSDF131228、JSNT131122和2株泰國(guó)株（M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95）組成Ⅲ群。遺傳進(jìn)化分析表明，江蘇省內(nèi)大部分PEDV與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)分離株、相鄰國(guó)家分離株和美國(guó)分離株親緣性較近，與歐洲分離株親緣性較遠(yuǎn)，這與目的基因的核苷酸分析結(jié)果相一致，與董延鵬[16]的研究結(jié)果相近。JSDF131228、JSNT131122與泰國(guó)1995年和2004年分離的M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95親緣性相近，且在國(guó)內(nèi)未有報(bào)道與泰國(guó)株（M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95）同源性如此相近的毒株，表明這2株P(guān)EDV可能是由國(guó)外傳入變異形成的，其他7株或在選擇壓力下由國(guó)內(nèi)本土毒株或國(guó)外毒株傳入變異而成的。江蘇省內(nèi)很多豬場(chǎng)依舊采用PED（CV777）弱毒苗進(jìn)行免疫，很有可能由于病毒突變而影響免疫效果，因此針對(duì)當(dāng)下流行的毒株選擇新的疫苗株來(lái)控制PED是當(dāng)務(wù)之急。

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