吳東　劉惠琴　徐力　田永強(qiáng)

摘要 [目的] 為飼用枯草芽孢桿菌的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。[方法] 通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果] 飼用枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基為：葡萄糖3%、酵母浸膏1.5%、磷酸氫二鈉0.2%、磷酸二氫鈉0.1%、硫酸鎂0.1%、酵母浸粉0.5%。飼用枯草芽孢桿菌的的最適發(fā)酵條件為：溫度38 ℃，初始 pH 7.0～7.2，搖床轉(zhuǎn)速 180 r/min，接種量 7%。選擇木屑質(zhì)量與發(fā)酵液體積（m/V）的混合比為3∶5，繼續(xù)高溫發(fā)酵16 h，芽飽產(chǎn)量可達(dá)到5.18×1010 CFU/g。[結(jié)論] 該研究可為飼用枯草芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞 枯草芽孢桿菌；發(fā)酵工藝；優(yōu)化；菌劑；制備

中圖分類號(hào) S816.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）19-134-04

飼用抗生素的使用在我國(guó)過(guò)去的很多年內(nèi)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展作出了突出的貢獻(xiàn)。但是，隨著社會(huì)和科技的發(fā)展，人們對(duì)食品安全越來(lái)越重視，抗生素產(chǎn)生一系列負(fù)面問(wèn)題（如耐藥性），引起飼料用藥及治療用藥量越來(lái)越高，并且過(guò)量使用抗生素容易導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)能力降低[1]?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌屬的一種，由于其在自然界廣泛分布，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生孢子時(shí)能分泌許多種酶類物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，穩(wěn)定性極好，具有耐氧化、抗擠壓、耐高溫、耐酸等特征[2]。此外，枯草芽孢桿菌抗逆性很強(qiáng)，能夠儲(chǔ)藏的時(shí)間較長(zhǎng)，它在顆粒或粉料中都有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，也能夠很通順地進(jìn)入動(dòng)物的大小腸道生存并且能夠大范圍繁殖，是在微生物飼料添加劑中應(yīng)用最為廣泛的益生菌。枯草芽孢桿菌不污染環(huán)境，不破壞生態(tài)，能夠抑制許多病原菌[3-6]。它還有一個(gè)最大的優(yōu)勢(shì)就是能夠產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，抗逆性強(qiáng)，在土壤和植物表面普遍存在，其芽孢可以制成粉劑和可濕性粉劑等各種生防制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，該制劑具有與化學(xué)農(nóng)藥混用而不失活的特性[7-9]。制劑中的芽孢含量是影響制劑應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其發(fā)酵條件，提高發(fā)酵液中芽孢含量，以期為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，有助于降低生產(chǎn)成本和提高制劑的生防效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用培養(yǎng)基

1.1.1 種子培養(yǎng)基。 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L[10-13]。

1.1.2 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。蔗糖20 g/L、蛋白胨15 g/L、酵母浸粉5 g/L，MgSO4 1 g/L， KH2PO4 2 g/L、K2HPO4 2 g/L，水1 000 ml，將pH調(diào)節(jié)至7.0，用于枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2 菌種 枯草芽孢桿菌CM0002，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.3 儀器與設(shè)備 控溫?fù)u床、高壓蒸氣滅菌鍋、電子天平、pH測(cè)定儀、無(wú)菌操作臺(tái)和紫外分光光度計(jì)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化。 將保存的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，活化3次，備用。

1.4.2 種子液的制備。 將保存的枯草芽抱桿菌接于新鮮培養(yǎng)皿平板，35 ℃條件下培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)好的平板菌種再接種于盛有50 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角燒瓶中，搖床35 ℃、160 r/min培養(yǎng)20 h。

1.4.3 生長(zhǎng)趨勢(shì)的測(cè)定。 取培養(yǎng)好的斜面種子，用接種環(huán)挑2環(huán)接種于盛有50 ml無(wú)菌種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，培養(yǎng)20 h，按照5%接種于盛有50 ml基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，按照上述試驗(yàn)確定的最優(yōu)化的培養(yǎng)基并采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)30 h。自接種后每2 h 取樣1 次測(cè)定菌發(fā)酵培養(yǎng)基的菌液的OD600，直至36 h。用未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.4.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。 分別用移液槍移動(dòng)2.5 ml種子液，接入盛有50 ml/250 ml基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中（接種量為5%，V/V）。置于搖床中，35 ℃條件下振蕩培養(yǎng)22 h，轉(zhuǎn)速為160 r/min，初始pH為7.0。

1.4.5 活菌生物量的測(cè)定。采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

1.4.6 培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)。

①最佳碳源的篩選。分別用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、牛肉膏采用相同的2%的添加量替換蔗糖，接種與培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)22 h后測(cè)定菌液的OD600 nm。用未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，以確定最佳的碳源。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取平均值。②最佳氮源的篩選。分別用胰蛋白胨、酵母浸膏、尿素、硫酸銨采用相同的1.5%的添加量替換蛋白胨，培養(yǎng)與處理方法同上。

③無(wú)機(jī)鹽的篩選。分別用0.4%的NaH2PO4（0.2%）+Na2HPO4（0.2%）、CaCl2、CaCO3等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的中0.2%NaH2PO4的與0.2%的Na2HPO4的復(fù)合鹽，培養(yǎng)與處理方法同上，配制培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

④發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的正交優(yōu)化。

將篩選出的最佳碳源設(shè)置1%、2%、3%3個(gè)處理，最佳氮源設(shè)置1.0%、1.5%、2.0%3個(gè)處理，最佳無(wú)機(jī)鹽設(shè)置0.1%、0.2%、0.3%3個(gè)處理，進(jìn)行正交試驗(yàn)。接種與培養(yǎng)條件不變，測(cè)定發(fā)酵液的OD600。用未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，以確定各主要營(yíng)養(yǎng)成分在發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加比例。

1.4.7 培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化試驗(yàn)。

采用最適培養(yǎng)基配方和固定搖瓶培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵時(shí)間、溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、接種量及裝液量進(jìn)行逐一優(yōu)化。①最佳培養(yǎng)溫度的優(yōu)化。按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方對(duì)枯草芽抱桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，接種量5%，pH 7.0，將接種后的培養(yǎng)基分別置于29、32、35、38、41 ℃條件下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160 r/min，22 h后測(cè)定菌液的OD600 nm。用未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取平均值。

②最佳初始pH的優(yōu)化。

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽抱桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，接種量5%，初始pH分別設(shè)置為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，轉(zhuǎn)速160 r/min振蕩培養(yǎng)。處理方法同上。

③最佳接種量的優(yōu)化。將枯草芽抱桿菌分別以1%、3%、5%、7%和9%的接種量接種于優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，并按照優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，轉(zhuǎn)速160 r/min振蕩培養(yǎng)。處理方法同上。④最佳裝液量的優(yōu)化。

將培養(yǎng)好的種子液以最優(yōu)接種量分別接于30、40、50、60、70 ml的已優(yōu)化的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在最優(yōu)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定菌液的OD600nm。用未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

⑤最佳搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化。

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方、接種量、裝液量、初始pH和培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽抱桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為120、140、160、180和200 r/min振蕩培養(yǎng)，處理方法同上。

1.4.8 枯草芽孢桿菌芽孢制備及干菌粉制備。①枯草芽孢桿菌芽孢的制備。將枯草芽孢桿菌接種于優(yōu)化好的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)完成后，在發(fā)酵好的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中分別加入等量的經(jīng)研磨、滅菌的（麻子秸稈粉、青草粉、木屑）放入40恒溫水浴鍋中繼續(xù)培養(yǎng)16 h后將混合有（麻子秸稈粉、青草粉、木屑）的發(fā)酵液放入80水浴鍋中水浴10 min，取樣品1 g放入滅菌試管，進(jìn)行梯度稀釋，取稀釋液0.5 ml，倒入LB固體培養(yǎng)基中涂布培養(yǎng)30 h后計(jì)數(shù)。

②枯草芽孢桿菌干菌粉的制備。將發(fā)酵好的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中分別加入等量的經(jīng)研磨、滅菌的（麻子秸稈粉、青草粉、木屑）放入40恒溫水浴鍋中繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，取出放入正空恒溫干燥箱中干燥，制備干菌粉。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

[14] 取培養(yǎng)好的平板，用接種環(huán)挑2環(huán)接種于盛有50 ml/250 ml無(wú)菌種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 h后按5%接種量接入已經(jīng)最優(yōu)化的培養(yǎng)基，并采用搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)30 h。自接種后每2 h取樣1次測(cè)定菌液的OD600，用未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。從圖1可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)0～2 h為枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)延緩期，細(xì)菌生長(zhǎng)極慢；2 h以后逐漸進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量急劇增多；在17 h達(dá)到生長(zhǎng)高峰期，12～17 h為枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，菌體生長(zhǎng)緩慢。17 h以后細(xì)菌數(shù)量開始減少，枯草芽孢桿菌進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期。因此，采用培養(yǎng)17 h的菌液作為菌種比較合適，此時(shí)枯草芽孢桿菌為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，既可保持高的細(xì)胞活力，又可獲得盡可能多的菌體生物量。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)化

2.2.1 最佳碳源的篩選。從圖2可以看出，以葡萄糖作為碳源時(shí)，枯草芽抱桿菌的生物量最大。葡萄糖可以在細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期作為枯草芽抱桿菌的最佳碳源，同時(shí)可以作為細(xì)胞合成的前體的物質(zhì)，因此選擇葡萄糖作為最佳碳源。

2.2.2 最佳氮源的篩選。

從圖3可以看出，以酵母浸膏作為氮源時(shí)，枯草芽抱桿菌的生長(zhǎng)量最大。因此，枯草芽孢桿菌的最佳氮源是酵母浸膏。

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽的篩選。

從圖4可以看出，以Na2HPO4+NaH2PO4（1∶1）作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，枯草芽抱桿菌的生長(zhǎng)量最大。因此，枯草芽抱桿菌的最佳無(wú)機(jī)鹽為Na2HPO4+NaH2PO4（二者比例為1∶1）。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量的正交優(yōu)化

[14] 由表1可知，這3種營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響大小順序?yàn)椋航湍附?葡萄糖>無(wú)機(jī)鹽。3種營(yíng)養(yǎng)成分經(jīng)優(yōu)化后最

佳的配比為：3%葡萄糖、1.5%酵母膏、0.2%磷酸氫二鈉、

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 最佳溫度的確定。從圖5可以看出，枯草芽抱桿菌的最適培養(yǎng)溫度是35 ℃。

2.4.2 最佳初始pH的確定。從圖6可以看出，液體發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽抱桿菌時(shí)的最適初始pH應(yīng)為7.0～7.5。

2.4.3 最佳接種量的確定。從圖7可以看出，當(dāng)接種量為7%時(shí)，發(fā)酵液中枯草芽抱桿菌的活菌數(shù)量達(dá)到最大，因此最佳的接種量應(yīng)為7%。

2.4.4 最佳裝液量的確定。從圖8可以看出，當(dāng)其他條件最優(yōu)時(shí)，最佳的裝液量為30 ml置于250 ml三角瓶中發(fā)酵。

2.4.5 最佳搖床轉(zhuǎn)速的確定。從圖9可以看出，液體發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽抱桿菌時(shí)的最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速應(yīng)為200 r/min。

2.5 枯草芽孢桿菌芽孢的制備 由表2可知，不同的固相支持物對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液形成芽孢有較好的促進(jìn)作用，其中木屑對(duì)飼用枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢率有明顯的促進(jìn)作用，其原因主要可能是發(fā)酵液里面的枯草芽孢桿菌菌體能夠借助固相支持物本身進(jìn)行吸附及同時(shí)借助固相支持物之間相互形成的空隙阻斷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)對(duì)芽孢形成起到促進(jìn)作用。因此，最后選擇木屑質(zhì)量與發(fā)酵液體積的比例為3∶5，以提高發(fā)酵液芽孢產(chǎn)率。

2.6 枯草芽孢桿菌干菌粉的制備 將發(fā)酵好的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中分別加入經(jīng)研磨、滅菌的木屑（與發(fā)酵液體積的比例為3∶5）放入40恒溫水浴鍋中繼續(xù)培養(yǎng)。取出目的產(chǎn)物放入正空恒溫干燥箱中干燥，等全部的物質(zhì)干燥完成后研磨制備成干菌粉。

3 小結(jié)

筆者通過(guò)搖瓶發(fā)酵對(duì)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明不同的培養(yǎng)條件、不同的碳氮源無(wú)機(jī)鹽及不同配比對(duì)枯草芽孢桿菌的生物量有很大的影響。培養(yǎng)溫度35 ℃、初始pH 7.0～7.5、裝液量30 ml和接種量7%的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)17 h，可以使菌體生物量達(dá)到最大值（7.90×109 CFU/g）。通過(guò)正交試驗(yàn)得到枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基為：葡萄糖3%、酵母膏1.5%、磷酸氫二鈉0.2%、磷酸二氫鈉0.1%。該試驗(yàn)結(jié)果僅是在三角瓶培養(yǎng)水平上獲得的，但若要實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，還需要進(jìn)行固體反應(yīng)器條件下的中間放大試驗(yàn)，同時(shí)該試驗(yàn)也為其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)微生物農(nóng)藥劑奠定了一定的實(shí)踐基礎(chǔ)。

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