張啟芳，吳昌學(xué)，禹文峰，官志忠，柏 華

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，貴州 都勻 558000)

套細(xì)胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma，MCL)是所有B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤中預(yù)后較差的腫瘤之一［1－2］。MCL 患者對化療加單克隆抗體的一線治療初始反應(yīng)良好，但幾乎所有的MCL 患者最終會復(fù)發(fā)，并對進(jìn)一步的治療反應(yīng)越來越差［3－5］。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，Dcs)是機(jī)體中最主要的抗原提呈細(xì)胞，在抗腫瘤免疫發(fā)應(yīng)中起重要作用［6－9］。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞分泌細(xì)胞因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、白介素-11(interleukin-11，IL-11)、分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等［10－14］抑制浸潤在腫瘤組織中的DCs 成熟，致使他們成為耐受性DCs，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路的激活是抑制DCs 成熟的一個關(guān)鍵［15－17］。本研究采用小鼠惡性B 細(xì)胞淋巴瘤A20細(xì)胞，利用低劑量放療誘導(dǎo)免疫原性的細(xì)胞死亡激活小鼠免疫系統(tǒng)，同時抑制STAT3 表達(dá)，探討聯(lián)合放療與抑制STAT3 表達(dá)對腫瘤浸潤樹突狀細(xì)胞(tumor-infiltrating dendritic cells，TIDCS)成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

小鼠惡性B 細(xì)胞淋巴瘤A20 細(xì)胞購自美國ATCC 公司，STAT3 探針購自Universal Probe Library(UPL)，兔抗STAT3(sc-8019)、羊抗β-actin(sc-1616)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(ZB-2301)、兔抗羊二抗(ZB-2306)購自美國Santa Cruz 公司，小鼠DCs 富集試劑盒(The StemSepTMMouse Dendritic Cell Enrichment Kit)購自加拿大STEMCELL Techonolgies 公司，熒光標(biāo)記抗體主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II、CD40、CD80 購自美國eBiosciences，Phospho-Tyr705-STAT3 Alexa Fluro647 購自BD Biosciences，胎牛血清、1x Antibiotic-Antimycotic、1640 培養(yǎng)液Gibco 公司，RNeasy Plus kit 購自Qiagen 公司，cDNA 合成試劑盒(iScript)購自Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 把A20 細(xì)胞放于含10%胎牛血清和1x Antibiotic-Antimycotic 的RPMI 1640 培養(yǎng)液，5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 小鼠帶瘤實(shí)驗(yàn) 在100 μL 1×PBS 中制備含5×106的A20 細(xì)胞懸浮，并接種于BALB 小鼠大腿皮下。根據(jù)公式V=L×W2/2 計算腫瘤體積(V 為體積，L 為瘤體的長，W 為寬)。待瘤塊長至約150 mm3時，隨機(jī)分為3 組，每組6 只，分別為PBS組、放療+空質(zhì)粒組(RT+empty)、放療+shRNA(RT+shRNA)組，分別于放療前、放療當(dāng)天和第二天瘤內(nèi)注射等量1×PBS、空載體和STAT3 基因特異pFLU-EGFP-Puromycin STAT3 shRNA 質(zhì)粒(按小鼠體重0.50 mg/kg)，放療前瘤內(nèi)注射STAT3 基因特異shRNA 質(zhì)粒1 次，腫瘤處放療10 Gy，放療當(dāng)天和第二天按小鼠體質(zhì)量0.50 mg/(kg·次)瘤內(nèi)注射質(zhì)粒。放療第三天收腫瘤。

1.2.3 腫瘤CDs 富集 用手術(shù)刀切碎腫瘤組織，加入膠原蛋白酶-IV/脫氧核糖核酸酶I(DNaseⅠ)處理，置于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱30 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI，2 000 r/min 離心10 min，用RPMI 洗細(xì)胞一次，計數(shù)細(xì)胞;按小鼠DCs 富集試劑盒說明書操作，富集小鼠TIDCs，用流式細(xì)胞儀驗(yàn)證。

1.2.4 STAT3 mRNA 表達(dá)水平 采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)方法，采用RNeasy 試劑提取細(xì)胞總RNA，按iScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，用qPCR 檢測STAT3 mRNA 表達(dá)水平。用ProbeFinder Version 2.45(Roche)軟件設(shè)計探針－引物，探針購自Universal Probe Library(UPL)，STAT3 上游引物序列為5'-CTGCCTAGATCGGCTAGAAAAC-3'，下游引物序列為5'-CCCTTTGTAGGAAACTTTTTGC-3'，內(nèi) 參 照TATA-box binding protein(TBP)采 用Roche’s Reference Assays。qPCR 反應(yīng)條件為95 ℃30 s，95 ℃5 s、60 ℃30 s(40 個循環(huán))。采集待測基因和內(nèi)參照TBP 的熒光信號值，計算ΔΔCt 及相對含量(RQ)，RQ=2–ΔΔCt。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜蛋白染色 染色緩沖液洗腫瘤DCs 1 次，小鼠CD16/32 抗體和小鼠血清封閉細(xì)胞膜FcγII/III 受體，冰上孵育10 min，2 000 r/min 離心10 min(細(xì)胞內(nèi)蛋白需用1.6%多聚甲醛固定、預(yù)冷的甲醇破膜，染色緩沖液清洗2 次，每次2 000 r/min 離心10 min)，加入用染色緩沖液稀釋熒光標(biāo)記抗體，冰上避光孵育30 min，染色緩沖液清洗2 次，重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀收集數(shù)據(jù)，用flowjo 軟件(treestar)分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpadprism 6.0 自帶統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。多組單變量實(shí)驗(yàn)間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA);P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT3 mRNA 和STAT3 磷酸化蛋白表達(dá)水平

與PBS 組和RT+empty 組比較，RT+shRNA組STAT3 mRNA 表達(dá)水平和磷酸化STAT3 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，分別被抑制了50%～60%和80%，說明放療聯(lián)合STAT3 基因特異的shRNA 可以有效地抑制腫瘤侵潤DCs 中STAT3 表達(dá)。

2.2 TIDCs 表面分子MCHII、CD40 及CD80 的表達(dá)水平

與PBS 組和RT+empty 組比較，RT+shRNA組MHCH、CD40及CD80平均熒光強(qiáng)度均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，分別增加了50%、60%和80%，說明放療聯(lián)合STAT3 基因特異的shRNA 可以有效增加TIDCs 表面分子MCHII、CD40 及CD80 的表達(dá)水平。

圖1 TIDCs STAT3 mRNA 和STAT3磷酸化蛋白表達(dá)水平Fig.1 Radiotherapy combined with STAT3 shRNA silencesd STAT3 mRNA and decreased STAT3 Activity

圖2 TIDCs 表面分子MHCII、CD40 及CD80 的表達(dá)水平Fig.2 The expression levels of MHCII，CD40 and CD80

3 討論

MCL 是一種進(jìn)展快、無法治愈的B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤亞型。本研究應(yīng)用STAT3 基因特異pFLU-EGFP STAT3 shRNA 質(zhì)粒注射惡性B 細(xì)胞淋巴瘤并給予腫瘤處10 Gy 放療處理，探討腫瘤侵潤DCs 表面分子MHCII、CD40 及CD80 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用STAT3 基因特異shRNA 聯(lián)合放療可上調(diào)腫瘤侵潤DCs 的表面MHCII 類分子與共刺激分子(CD40 和CD80)的表達(dá)，有效地促進(jìn)腫瘤侵潤DCs 成熟。

免疫細(xì)胞能夠殺死腫瘤化療耐藥細(xì)胞［7－8］，激活MCL 患者的免疫系統(tǒng)可引起機(jī)體持續(xù)的免疫應(yīng)答［12］。因此，激活具有抗原提呈功能的DCs 成為治療腫瘤的首先策略之一。DCs 遷移能力強(qiáng)，浸潤到腫瘤組織，但腫瘤細(xì)胞分泌細(xì)胞因子可抑制浸潤在腫瘤組織中的DCs 成熟，成為耐受性DCs［10－14］。耐受性DCs 表面MHC Ⅱ類分子與共刺激分子(CD40 和CD80)均為低表達(dá)或不表達(dá)，不能有效的提呈抗原激活CD8+T 細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞免疫逃逸［6－9］。STAT3 調(diào)控DCs 分化和成熟，抑制STAT3 表達(dá)能促進(jìn)DCs 分化和成熟［10－12，15－16］。放療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時，還誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，因死亡細(xì)胞具有免疫原性，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，消除遠(yuǎn)端病灶［18－19］;但大劑量放療對癌癥患者副作用較大，臨床常使用小劑量多次放射療法。但對于放療后復(fù)發(fā)患者，放療效果較差;前人和筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，放療誘導(dǎo)的死亡細(xì)胞也釋放如線粒體DNA、IL-6 等因子激活殘余腫瘤細(xì)胞中的STAT3 蛋白，激活的STAT3 蛋白又促進(jìn)腫瘤生長，引起復(fù)發(fā)［20］。這就造成多次放療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多次死亡，但又多次激活腫瘤細(xì)胞中的STAT3蛋白，持續(xù)性促進(jìn)腫瘤生長。因此本研究嘗試一次放療聯(lián)合抑制STAT3 表達(dá)是否能殺死腫瘤細(xì)胞，協(xié)同激活免疫系統(tǒng)，抑制殘余腫瘤細(xì)胞的STAT3表達(dá)，規(guī)避放療的不足，阻止腫瘤復(fù)發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一次放療聯(lián)合抑制STAT3 表達(dá)在降低STAT3 mRNA 表達(dá)水平的同時引起STAT3 磷酸化蛋白表達(dá)下降，上調(diào)TIDCs 的表面MHCⅡ類分子與共刺激分子(CD40 和CD80)的表達(dá)，促進(jìn)TIDCs 成熟。這種聯(lián)合治療是否能增強(qiáng)惡性B 細(xì)胞的免疫原性功能還有待進(jìn)一步研究。

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