武 飛，肖 婉，徐 冉，王建塔，湯 磊，梁 冰＊

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025;2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

天葵為毛茛科多年生草本植物，可入藥。富含造血功能的鐵素、維生素A 原、黃酮類化合物及酶化劑錳元素，具有活血，解毒消腫等功效，在民間天葵常用于兒童和老人的保健，是一種很好的營養(yǎng)保健品［1－3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)天葵可增強(qiáng)正常小鼠的免疫功能。為了進(jìn)一步探討天葵對機(jī)體免疫功能影響可能的機(jī)制，本研究采用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)，誘導(dǎo)免疫抑小鼠動物模型，利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA 法)檢測小鼠血清中免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，觀察天葵—正丁醇提取物TK 對免疫抑制小鼠免疫功能的影響，為天葵的進(jìn)一步開發(fā)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 清潔級昆明種小鼠50 只，l8～22 g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SYXK(黔)2012－0001。隨機(jī)均分成TK 高、中、低劑量組、正常對照組(對照組)、CTX 免疫抑制模型組(模型組)。

1.1.2 TK 的制備 天葵藥材購于貴陽市藥材市場，經(jīng)貴陽醫(yī)學(xué)院龍慶德副教授鑒定為毛茛科天葵屬植物天葵的干燥塊根，產(chǎn)地貴州。將購買的天葵干燥粉碎，依次用甲醇回流提取和正丁醇萃取，得到TK，于－20 ℃保存，臨用時(shí)用蒸餾水稀釋至所需濃度(1 mg TK 相當(dāng)于生藥量20.7 mg)。

1.1.3 主要試劑 CTX 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，14011725);白細(xì)胞介素－2(IL－2)、白細(xì)胞介素－4(IL－4)、白細(xì)胞介素－10(IL－10)及干擾素－γ(IFN－γ)ELISA 檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為H003、H005、H009 及H025)。

1.2 方法

1.2.1 CTX 免疫抑制小鼠模型的制備［4－5］對照組和模型組小鼠灌胃給予生理鹽水0.2 mL/10 g;TK 高、中、低劑量組分別給予200 mg/kg、100 mg/kg 及50 mg/kg TK 灌胃，1 次/d，連續(xù)11 d。第9、第10 及第11 天灌胃后，模型組和TK 組腹腔注射CTX 100 mg/(kg·d);對照組注射等量生理鹽水。

1.2.2 血清IL－2、IL－4、IL－10 及IFN－γ 含量檢測 造模第12 天時(shí)，麻醉小鼠摘眼球取血，分離血清，采用ELISA 法檢測血清中的IL－2、IL－4、IL－10 及IFN－γ 的含量，按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與正常對照組相比，模型組小鼠血清IL－2、IL－4、IL－10 及IFN－γ 含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與模型組相比，TK 高、中、低劑量組血清中的IL-2、IL-4 含量明顯升高，TK 高劑量組血清中IFN－γ 含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠IL－2、IL－4、IL－10 及IFN－γ 含量Tab.1 The level of cytokines in serum of the immunosuppressive mice induced by CTX

3 討論

免疫抑制動物模型的制備方法很多，有免疫缺陷動物模型，如短壽新西蘭鼠(NZB)、裸小鼠、MLR－lpr 小鼠及先天性補(bǔ)體C2、C4 缺乏小鼠等［4］。也可用免疫抑制劑CTX、氫化可的松、可的松或輻射方法制備免疫力低下動物模型，以CTX 最為常用。CTX 是一種細(xì)胞毒化療藥物，屬于烷化劑類，能在細(xì)胞水平上干擾核酸的合成，用于多種腫瘤的治療;CTX 同時(shí)亦是一種免疫抑制劑，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，可損傷自身免疫細(xì)胞，造成機(jī)體免疫力低下［5］。用CTX 作為免疫抑制劑制備免疫抑制模型，可在細(xì)胞的各個時(shí)期發(fā)揮作用，不僅可抑制細(xì)胞免疫，還可抑制體液免疫。

細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的具有多種生物活性的小分子蛋白質(zhì)，包括白細(xì)胞介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趨化因子(CF)及生長因子等［6］。血清中的IL－2、IL－4、IL－10 和IFN－γ 等細(xì)胞因子在機(jī)體內(nèi)主要由活化的輔助性T 細(xì)胞(helper T cell，Th)分泌［6－7］。Th細(xì)胞前體(Th cell precursor)是未接觸抗原的T 細(xì)胞，它們通過接觸天然免疫細(xì)胞攝取的抗原而分化成一種不確定的狀態(tài)，稱為Th0細(xì)胞;隨后Th0細(xì)胞再按一定比例分別向Th1亞群或Th2亞群分化［6－7］。Th1細(xì)胞主要分泌IL－2、IFN－γ 等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，在誘發(fā)器官特異性自身免疫病、器官移植排斥反應(yīng)和抗感染免疫中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。Th2細(xì)胞主要分泌IL－4、IL－10 等細(xì)胞因子，主要調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)，在誘發(fā)過敏反應(yīng)中起著決定性的作用。本次研究中通過ELISA 法檢測了與細(xì)胞免疫和體液相關(guān)的細(xì)胞因子IL－2、IFN－γ 和IL－4、IL－10，結(jié)果表明TK 提取物各劑量組可顯著提高免疫抑制模型小鼠血清中IL－2 含量;高劑量可顯著提高小鼠血清中IFN－γ 含量;各劑量組也顯著提高了模型小鼠血清中IL－4 含量，提示TK 提取物可同時(shí)增增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞和體液免疫。增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能可能與提高血清中的IL－2 和IFN－γ 水平有關(guān)，而增強(qiáng)體液免疫功能可能與提高血清中IL－4 水平有關(guān)。分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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