武 飛，張閩閩，羅 明，徐 冉，王建塔，湯 磊，梁 冰＊

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

天葵［semiaguilegia adoxoides(DC.)makino］為毛茛科天葵屬多年生草本植物，其塊根及種子可供藥用，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，用于治療乳腺炎、扁桃體炎、癰腫、瘰疬、小便不利以及毒蛇咬傷等癥［1－2］。天葵營(yíng)養(yǎng)較為豐富，微量元素鈣、錳、鐵、鋅、銅等含量較高，其含有的黃酮甙成分對(duì)惡性生長(zhǎng)細(xì)胞亦有一定對(duì)抗作用。此外，天葵還有抗寄生蟲(chóng)和抗病毒的作用，可增強(qiáng)人體的免疫能力［3］。本研究采用碳粒廓清法、半數(shù)溶血值法以及環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制模型，綜合評(píng)價(jià)天葵提取物(TK)對(duì)小鼠免疫功能及肝、腎功能的影響，為天葵的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，18 ～22 g，雌雄各半，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)SYXK(黔2012－0001)。

1.1.2 TK 的制備 天葵藥材購(gòu)于貴陽(yáng)市藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院龍慶德副教授鑒定為毛茛科天葵屬植物天葵的干燥塊根，產(chǎn)地貴州。將購(gòu)買的天葵干燥粉碎，依次用甲醇回流提取和正丁醇萃取，得到天葵－正丁醇提取物，于－20 ℃保存，臨用時(shí)用蒸餾水稀釋至所需濃度(1 mg 天葵－正丁醇提取物相當(dāng)于生藥量20.7 mg)。

1.1.3 主要試劑 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，14011725)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為C010－1;C009－1;C013－1);綿羊紅細(xì)胞(SRBC)由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 TK 急性毒性實(shí)驗(yàn) 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，未測(cè)到TK對(duì)小鼠的LD50，因此進(jìn)行小鼠最大耐受量實(shí)驗(yàn)。取小鼠20 只，雌雄各半，隨機(jī)分為給藥組和正常對(duì)照組，每組10 只。給藥組予5 g/kg TK、2 次/d 灌胃，連續(xù)14 d，觀察小鼠的反應(yīng);正常對(duì)照組給予等量的生理鹽水［4］。

1.2.2 碳粒廓清實(shí)驗(yàn) 取小鼠40 只，雌雄各半，隨機(jī)分成4 組，TK 設(shè)高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)劑量組和正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)。各組每天灌胃1 次，連續(xù)7 d。對(duì)照組給予等量生理鹽水。于末次給藥后24 h，從小鼠尾部靜脈注入稀釋的(1∶4)印度墨汁0.1 mL/10 g，分別于2 min(t1)、10 min(t2)后從眼眶內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)t1、t2時(shí)的吸光度值A(chǔ)1、A2。取血完畢同時(shí)，將小鼠頸椎脫臼處死，取其肝臟、胸腺和脾臟，稱重。計(jì)算碳廓清指數(shù)K、吞噬指數(shù)α、脾臟指數(shù)以及胸腺指數(shù)［5］(公式中m 為重量)。

碳廓清指數(shù)K=(log A1－log A2)/(t2－t1)

吞噬指數(shù)α=m(動(dòng)物)/m(肝臟+脾臟)×K1/3

脾臟指數(shù)=m(脾臟)/m(動(dòng)物體重)×100%

胸腺指數(shù)=m(胸腺)/m(動(dòng)物體重)×100%

1.2.3 血清溶血素形成實(shí)驗(yàn) 取小鼠40 只，雌雄各半，隨機(jī)分成TK 高、中、低劑量組和對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)(方法同1.2.2)。給藥組每天灌胃1 次，連續(xù)10 d;對(duì)照組給予等量生理鹽水。于給藥第6 天每只鼠腹腔注射綿羊紅細(xì)胞懸液(SRBC)0.2 mL，第11 天摘除眼球取血，分離血清，用生理鹽水稀釋400 倍。取上述稀釋好的血清樣品1 mL，放入冰水浴中，依次加入10%的SRBC 0.5 mL，加入1∶10 的稀釋豚鼠血清1 mL，另設(shè)不加補(bǔ)體以生理鹽水代替的空白對(duì)照管，37 ℃孵育10 min 后，放入冰浴中終止反應(yīng)。2 000 r/min 離心10 min，取上清1mL，加入3 mL 都氏液，混勻，放置10 min，于540 nm 波長(zhǎng)處比色。按下式計(jì)算每個(gè)樣品的HC50，以半數(shù)溶血值HC50表示血清溶血素水平。

另取0.25 mL 經(jīng)洗滌過(guò)的SRBC 懸液，用都氏試劑稀釋至4 mL，搖勻放置10 min，于540 nm 波長(zhǎng)處比色，得到SRBC 半數(shù)溶血時(shí)的吸光度值。以上各組小鼠眼球取血后，立即頸椎脫臼處死，分別取胸腺、脾臟，稱重并計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)(方法同1.2.2)。

1.2.4 CTX 誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型 取小鼠50 只，雌雄各半，隨機(jī)分成5 組，分別為TK 高、中、低劑量組(方法同1.2.2)、正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)以及CTX 免疫抑制模型組(簡(jiǎn)稱模型組)。對(duì)照組和模型組灌胃給予生理鹽水0.2 mL/10 g;藥物高、中、低劑量組灌胃給予相應(yīng)劑量TK，每日1次，連續(xù)11 d。第9、10 和11 天灌胃后，模型組和藥物組腹腔注射CTX 100 mg/(kg·d);對(duì)照組注射等量生理鹽水［6］。第12 天，小鼠稱重后摘眼球取血，分離血清，檢測(cè)血清中的ALT、AST、BUN 的含量。以上各組小鼠眼球取血后，立即頸椎脫臼處死，取其胸腺、脾臟，稱重并計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)(方法同1.2.2)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TK 急性毒性實(shí)驗(yàn)

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，未測(cè)到TK 對(duì)小鼠的LD50，在最大給藥濃度和最大給藥體積下，小鼠生長(zhǎng)良好，未見(jiàn)死亡;兩組小鼠的體重變化情況見(jiàn)表1。

2.2 TK 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)和免疫器官臟器指數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，TK 高、中劑量組吞噬指數(shù)增加，脾臟指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 TK 對(duì)小鼠體重的影響Tab.1 Effcet of TK on mouse weight in different periods

表1 TK 對(duì)小鼠體重的影響Tab.1 Effcet of TK on mouse weight in different periods

組別 n 給藥前3 d小鼠7體d重(g)10 d 14 d對(duì)照組 10 19.1±1.4 19.8±1.6 21.2±1.8 24.3±1.8 28.5±2.2給藥組 10 18.8±1.6 19.6±2.0 20.8±2.1 23.6±1.9 27.7±2.1

表2 TK 對(duì)小鼠吞噬指數(shù)及免疫器官臟器指數(shù)的影響Tab.2 Effect of TK on index of phagocytosis and viscera of mice

表2 TK 對(duì)小鼠吞噬指數(shù)及免疫器官臟器指數(shù)的影響Tab.2 Effect of TK on index of phagocytosis and viscera of mice

(1)與對(duì)照組相比，P ＜0.05

組別 n 吞噬指數(shù)α 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)對(duì)照組10 2.67±0.54 2.54±0.37 3.57±0.32 TK 高劑量組 10 4.46±0.71(1) 2.28±0.23 4.84±0.38(1)TK 中劑量組 10 3.28±0.56(1) 2.32±0.57 4.24±0.66(1)TK 低劑量組10 2.78±0.48 2.73±0.32 3.84±0.37

2.3 TK 對(duì)小鼠血清溶血素及免疫器官臟器指數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，TK 高、中劑量組HC50增加，脾臟指數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 TK 對(duì)小鼠HC50及免疫器官臟器指數(shù)的影響Tab.3 Effect of TK on HC50 and index of viscera of mice

表3 TK 對(duì)小鼠HC50及免疫器官臟器指數(shù)的影響Tab.3 Effect of TK on HC50 and index of viscera of mice

(1)與對(duì)照組相比，P ＜0.05

組別 n HC50胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)對(duì)照組10 148.93±25.06 3.17±0.28 4.58±0.22 TK 高劑量組 10 279.25±47.17(1) 3.47±0.24 5.93±0.47(1)TK 中劑量組 10 185.20±25.92(1) 2.93±0.47 5.24±0.27(1)TK 低劑量組10 146.84±20.24 2.72±0.29 4.92±0.41

2.4 TK 對(duì)CTX 免疫抑制小鼠肝、腎功能及免疫器官臟器指數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清ALT、AST、BUN 含量升高，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)降低;與模型組相比，TK 各劑量組血清中的ALT、AST 及BUN含量明顯降低，高、中劑量組脾臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 TK 對(duì)CTX 免疫抑制小鼠肝腎功能及臟器指數(shù)的影響Tab.4 Effect of TK on the function of liver，kidney and index of viscera in the immunosuppressive mice induced by CTX

表4 TK 對(duì)CTX 免疫抑制小鼠肝腎功能及臟器指數(shù)的影響Tab.4 Effect of TK on the function of liver，kidney and index of viscera in the immunosuppressive mice induced by CTX

(1)與對(duì)照組比，P ＜0.05;(2)與CTX 模型組比，P ＜0.05

指標(biāo) 對(duì)照組 模型組 TK 高劑量組 TK 中劑量組 TK 低劑量組ALT(U/L) 50.25±8.69 136.10±16.41(1) 80.36±13.67(2) 93.72±10.45(2) 111.78±9.62(2)AST(U/L) 80.35±12.35 185.47±20.13(1) 115.72±18.45(2) 128.12±13.37(2) 146.82±11.78(2)BUN(mmol/l) 109.17±13.16 175.83±20.47(1) 153.96±18.20(2) 148.34±15.39(2) 125.21±9.27(2)胸腺指數(shù) 3.64±0.30 1.87±0.10(1) 1.62±0.08 1.84±0.05 2.02±0.07脾臟指數(shù) 4.67±0.20 3.18±0.30(1) 5.12±0.20(2) 4.58±0.40(2)3.87±0.10

3 討論

天葵作為一種民間用藥，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較強(qiáng)的保健功效，近年來(lái)備受人們的青睞。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)天葵免疫功能的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要從多方面綜合探討了天葵對(duì)小鼠免疫功能的影響。

機(jī)體的免疫功能主要分為非特異性免疫和特異性免疫。特異性免疫主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫。單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一。而碳粒廓清實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞吞噬能力，吞噬指數(shù)越高說(shuō)明巨噬細(xì)胞的吞噬能力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)觀察了TK 對(duì)正常小鼠吞噬指數(shù)的影響，結(jié)果表明，TK 高劑量和中劑量組對(duì)正常小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力有顯著的促進(jìn)作用，能提高小鼠非特異性免疫功能。血清溶血素形成實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)價(jià)體液免疫功能。本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定了小鼠血清中HC50值，結(jié)果表明，天葵提取物高、中劑量可顯著提高正常小鼠HC50值，說(shuō)明天葵提取物可增強(qiáng)小鼠的體液免疫功能。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，胸腺的主要功能是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和分泌胸腺素，主要參與細(xì)胞免疫;脾臟中有豐富的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，但B 淋巴細(xì)胞比例較大，因此與體液免疫關(guān)系更為密切。本研究結(jié)果顯示，天葵提取物對(duì)正常小鼠脾有增重作用，亦能對(duì)抗CTX 引起的脾萎縮，因而對(duì)促進(jìn)小鼠的體液免疫有一定作用。CTX 作為免疫抑制劑，在臨床應(yīng)用過(guò)程中具有一定的肝、腎毒性。本次實(shí)驗(yàn)觀察了TK 對(duì)CTX 誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠肝腎功能的影響。ALT 和AST 主要存在于肝臟中，當(dāng)肝細(xì)胞損傷或壞死時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)的ALT 和AST 釋放入血，導(dǎo)致血液中酶含量相應(yīng)升高。BUN 是人體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物，在腎功能正常的情況下，BUN 從腎小球?yàn)V過(guò)。當(dāng)腎臟損傷時(shí)，腎小球?yàn)V過(guò)功能減低，BUN 因潴留而增高，故其可用作反映腎功能的指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了CTX 免疫抑制小鼠血清中的ALT、AST、BUN 含量，結(jié)果表明TK 能夠降低血清中的ALT、AST、BUN 的含量，提示TK能夠?qū)笴TX 引起小鼠肝、腎的損傷。

綜上所述，TK 能增強(qiáng)小鼠的免疫功能，并對(duì)小鼠的肝、腎功能具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步的深入研究。

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