陳 漁，胡 珊，王彥青，王 林，王建光

(1.貴州醫(yī)科大學 疼痛診療學教研室，貴州 貴陽 550004;2.復旦大學上海醫(yī)學院 中西醫(yī)結(jié)合系，上海 200032;3.上海交通大學附屬第六醫(yī)院奉賢分院 疼痛科，上海 201400)

酒精被公認為是影響各種神經(jīng)遞質(zhì)釋放的飲料，不僅影響γ-氨基丁酸、谷氨酸、多巴胺、5-羥色胺及內(nèi)源性阿片肽等遞質(zhì)釋放［1］，而且使大腦組織白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等表達增加，尤其是使海馬區(qū)域炎性細胞因子表達明顯增多［2］。炎癥和炎癥細胞因子幾乎參與抑郁癥的發(fā)病機制中的下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸，神經(jīng)遞質(zhì)代謝，海馬神經(jīng)再生和突觸可塑性等途徑［3］。Toll 樣受體(TLR2/4)屬于Toll 樣受體家族，有研究表明TLR2/4 的高表達與許多炎癥性疾病有關［4］。因此炎癥或炎癥標記物可能有助于抑郁癥病理及治療機制的研究。本研究擬探討電針對急性酒精灌胃后抑郁樣行為大鼠海馬組織的TLR2/4 和炎性細胞因子的影響，為臨床電針治療酒精導致的行為改變提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性成年SD 大鼠，體重180 ～200 g，購自中國科學院上海實驗動物中心。動物飼養(yǎng)按12 h/12 h 晝夜交替，自由攝食飲水，保持恒溫(21±1)℃，相對濕度約55%，室內(nèi)噪音低于60 dB，環(huán)境適應1 周后進行實驗。動物處理符合國際實驗動物使用準則。

1.2 主要試劑

Trizol Reagent 購自invitrogen 公司，iScript cDNA Synthesis Kit、iQ SYBR Green Supermix 購 自Bio-Rad 公司;上下游引物由上海生物工程技術服務有限公司合成，見表1。

表1 上下游引物序列Tab.1 Sequences of the forward and reverse primers

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 將48 只大鼠隨機分成2 組，各24 只，生理鹽水對照組(Control，生理鹽水溶液灌胃)和酒精模型組(Ethanol，50%酒精5 g/kg 灌胃)。參照文獻［5］，造模前12 h 禁食，2 h 禁水。通過強迫游泳實驗和曠場實驗觀察兩組的行為學改變，若出現(xiàn)抑郁樣癥狀提示造模成功。強迫游泳實驗(forced swimming test，F(xiàn)ST):實驗大鼠在酒精造模前預游泳。將大鼠放入高40 cm、直徑18 cm的玻璃圓筒內(nèi)，筒內(nèi)水位15 cm，水溫22 ～23 ℃，15 min 后取出，用45 w 白熾燈烘干;第2 天相同時間段將大鼠再次放入圓筒內(nèi)，記錄造模前5 min 內(nèi)大鼠靜止時間(大鼠輕微擺動四肢保持頭部或鼻部露出水面評判為靜止狀態(tài)。酒精造模后同時間段采取該方法記錄各組大鼠5 min 內(nèi)靜止時間;與生理鹽水對照組比較，靜止時間明顯延長可反映大鼠產(chǎn)生抑郁，造模成功。曠場實驗(open field test，OFT)裝置由不透明材料制成，底面黑色為100 cm×100 cm 的正方形，側(cè)壁高45 cm。在造模后24 h、72 h 分別進行測試前用5%的醋酸水溶液徹底清潔敞箱，并擦干，同時開啟攝像監(jiān)控器，記錄5 min內(nèi)各只大鼠水平運動和直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀爬墻壁為垂直運動1 次)，醋酸清洗后進行下一只大鼠;用曠場視頻分析系統(tǒng)分析大鼠水平運動總路程和直立總次數(shù);同時觀察每只大鼠的探究行為及運動能力，探究行為和運動能力比生理鹽水組明顯下降，可表明大鼠產(chǎn)生抑郁，造模成功。隨機從Control 組和Ethanol 組各抽取12 只大鼠，為生理鹽水加電針組(Control+EA)和酒精模型加電針組(Ethanol+EA)，均予電針刺激(1 次/d)。

1.3.2 電針治療 安靜環(huán)境下，將大鼠軀干固定于木架上，頭部和四肢可以自由活動，待大鼠平靜10 min 后，將0.3 mm×1.3 cm 銀針刺大鼠百會穴和右側(cè)足三里穴，針刺深度0.4 cm，定位參照文獻［6］。Control+EA 和Ethanol+EA 組在酒精或生理鹽水灌胃后第24 h、48 h、72 h(1 次/d)使用一個回路的兩個電極，連接韓氏電針儀，進行通電治療。給予疏密波(疏波頻率2 Hz，串長2.5 s，密波頻率約15 Hz，串長2.5 s)，強度以引起大鼠耳朵和腿部肌肉輕微抖動而不嘶叫為宜(1 ～2 mA)，持續(xù)30 min。

1.3.3 大鼠海馬TLR2/4 及IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 檢測 (1)總RNA 的提取(Trizol 法)，各組(Control、Ethanol、Control+EA 和Ethanol+EA 組)均在實驗24h、72h 取大鼠海馬組織，按照Trizol 試劑盒說明書在無菌無酶冰浴條件下提取總RNA;(2)按照iScript cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應，把RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;(3)用iQ SYBR Green Supermix 試劑盒進行PCR 擴増;(4)使用IQ5 多重實時熒光定量PCR 儀所帶軟件進行樣本自動分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差()表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且組間比較方差齊性檢驗(P ＞0.05)的基礎上，采用方差分析(one-way ANOVA)進行比較，差異用LSD 進行統(tǒng)計分析;若方差不齊，采用非參數(shù)檢驗。以P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學改變

急性酒精造模后24 h、72 h，Ethanol 組與Control 組相比較，大鼠的靜止時間明顯增多，水平運動總路程和直立總次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，Ethanol 組大鼠造模成功。見表2 和表3。

表2 兩組大鼠FST 結(jié)果Tab.2 Forced swimming test results of rats in the two groups

表2 兩組大鼠FST 結(jié)果Tab.2 Forced swimming test results of rats in the two groups

(1)與Control 組比較，P ＜0.05

靜止時間(s/5min)組別造模后24 h 造模后72 h Control 組164.98±6.21 105.99±20.01 Ethanol 組 202.88±12.25(1) 184.13±12.54(1)

表3 兩組大鼠OFT 結(jié)果Tab.3 Open field test results of rats in the two groups

表3 兩組大鼠OFT 結(jié)果Tab.3 Open field test results of rats in the two groups

(1)與Control 組比較，P ＜0.05

水平運動總路程(cm)直立(次)組別24 h 72 h 24 h 72 h Control 組1 528.55±130.19 1 544.33±144.31 27.83±2.66 23.17±2.69 Ethanol 組 637.05±86.58(1)585.60±148.69(1)15.00±1.25(1)12.57±1.54(1)

2.2 海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達

急性酒精灌胃后24 h 和72 h，與Control 組比較，Ethanol 組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達明顯增加(P ＜0.05)，Control+EA 組無明顯差異(P ＞0.05);與Ethanol 組相比，Ethanol+EA 組的IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達顯著減少(P ＜0.05);Control+EA 與Ethanol+EA 兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見表4。

2.3 海馬組織TLR2、TLR4 mRNA 表達

急性酒精灌胃后24 h 和72 h，與Control 組比較，Control+EA 組無明顯差異(P ＞0.05)，而Ethanol 組大鼠TLR2、TLR4 mRNA 的表達明顯增加(P ＜0.05);與Ethanol 組相比，Ethanol+EA 組TLR2、TLR4 mRNA 的表達顯著減少(P ＜0.05);Control+EA 與Ethanol+EA 兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見表5。

表4 電針對大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達的影響(，n=6)Tab.4 The effect of EA on expressions of IL-1β，IL-6 and TNF-α mRNA in hippocampus of acute ethanol administration-induced depression rats

表4 電針對大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達的影響(，n=6)Tab.4 The effect of EA on expressions of IL-1β，IL-6 and TNF-α mRNA in hippocampus of acute ethanol administration-induced depression rats

(1)與Control 組比較，P ＜0.05;(2)與Ethanol 組比較，P ＜0.05

組別 24 h IL-1β 72 h 24 h IL-6 72 h24 h TNF-α 72 h Control 組 1.04±0.35 1.17±0.58 1.03±0.26 1.25±0.82 1.04±0.30 1.05±0.37 Control+EA 組 1.04±0.29 1.17±0.29 1.12±0.35 1.43±0.61 0.97±0.25 1.05±0.08 Ethanol 組 3.32±1.45(1) 3.85±1.43(1) 5.04±2.63(1) 4.63±1.91(1) 2.97±1.20(1) 2.57±0.54(1)Ethanol+EA 組 0.81±0.40(2) 1.62±0.77(2) 0.83±0.38(2) 1.06±0.63(2) 0.98±0.31(2) 1.40±0.57(2)

表5 電針對急性酒精抑郁大鼠海馬組織TLR2、TLR4 mRNA 表達的影響(，n=6)Tab.5 The effect of EA on expressions of TLR2 and TLR4 mRNA in hippocampus of acute ethanol administration-induced depression rats

表5 電針對急性酒精抑郁大鼠海馬組織TLR2、TLR4 mRNA 表達的影響(，n=6)Tab.5 The effect of EA on expressions of TLR2 and TLR4 mRNA in hippocampus of acute ethanol administration-induced depression rats

(1)與Control 組比較，P ＜0.05;(2)與Ethanol 組比較，P ＜0.05

TLR2TLR4組別24 h 72 h24 h 72 h Control 組1.01±0.17 1.27±0.38 1.06±0.41 1.03±0.27 Control+EA 組0.79±0.24 1.01±0.44 0.66±0.30 1.04±0.43 Ethanol 組 2.40±0.50(1)2.01±0.50(1)3.48±2.07(1)2.21±0.41(1)Ethanol+EA 組1.02±0.32(2)1.21±0.30(2)1.08±0.42(2)1.25±0.38(2)

3 討論

本實驗制作的急性灌酒后大鼠抑郁樣行為模型，模擬人類急性飲酒代謝后行為改變的發(fā)生和機理，可用于其病理生理機制研究。該模型在24 h、72 h 通過強迫游泳實驗和曠場實驗衡量大鼠抑郁樣行為，而日常生活或臨床工作中酒精代謝后抑郁癥狀輕，異常行為持續(xù)時間短暫，易被忽略，也無便捷可靠的治療方法，這可能存在潛在的危害。本研究中，急性灌酒后24 h、72 h，Ethanol 組大鼠靜止不動時間較Control 組明顯延長，可反映動物的絕望狀態(tài);Ethanol 組較Control 組大鼠水平運動總路程和垂直運動總次數(shù)顯著性減少，反映自發(fā)性探究行為和運動能力明顯下降，表明大鼠活動度和對新鮮事物的好奇程度降低。成功模擬臨床上抑郁癥病人的情緒低落，興趣喪失、活動減少癥狀，提示造模成功。強迫游泳實驗和曠場實驗也常作為評價抑郁癥研究的行為指標［7-8］。

本實驗顯示急性灌酒后24 h、72 h 與Control組比較，Ethanol 組大鼠海馬組織的TLR2/4、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達明顯增加(P ＜0.05)，表明急性酒精可以激活TLR2/4 受體，增加炎性細胞因子的釋放。目前大部分研究認為慢性或急性酒精暴露引起的行為或認知障礙與TLR4 有關，機制可能是激活TLR(尤其TLR4)下游的MAPK、MyD88、NF-κB 通路，上調(diào)其主要的炎性靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，從而增加細胞釋放炎性因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α 等)，引起炎性損害等［9-11］。有研究報道，急性酒精暴露后成年嚙齒動物大腦多個區(qū)域細胞因子表達改變，尤其IL-6 的表達明顯增加［12］。在抑郁癥的患者血和腦脊液中發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達增加，提示炎性細胞因子可能影響抑郁癥的發(fā)生［13］。這些研究結(jié)果都與本研究大體一致，個別指標不同的原因考慮可能為模型動物、造模方式、觀察指標等因素所致;本研究結(jié)果提示急性灌酒可能是通過酒精刺激TLR2/4 樣受體，激活下游的通路，增加炎性細胞因子的釋放，導致大腦組織炎癥反應，引起相應的抑郁樣行為［14］。

目前認為針刺治療有利于中樞神經(jīng)系統(tǒng)生物化學平衡的維持和機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的恢復。本研究通過低頻電針刺激足三里穴和百會穴使得大鼠造模后抑郁樣行為明顯改善，QRT-PCR 結(jié)果顯示在24 h、72 h 與Ethanol 組 相 比，Ethanol+EA 組TLR2/4、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達顯著減少(P ＜0.05)，趨于正常。提示電針能有效的緩解急性灌酒后大鼠抑郁樣行為。早前Chen XH［15-16］認為不同頻率的電針可以激發(fā)不同的受體，2/15 Hz 低頻電針治療可調(diào)節(jié)大鼠脊髓上μ、δ、κ 三種類型阿片受體釋放，而如前言所述酒精刺激這些內(nèi)源性阿片肽的釋放增加，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)密切相關。王育紅等［17］人認為低頻電針不僅能抑制大鼠飲酒行為、戒斷反應，也能改善抑郁癥狀［18］。近期研究認為電針能抑制TLR2/4、IL-1β、TNF-α 蛋白表達［19］。電針刺激足三里穴和百會穴不僅能抑制酒精行為敏化，而且調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，發(fā)揮抗抑郁和改善空間學習記憶障礙的作用［20-22］。而抗抑郁機制主要是與炎癥和炎癥細胞因子的減少有關［23］。根據(jù)以往研究，再結(jié)合本實驗結(jié)果，可推測低頻電針抑制急性灌酒后的抑郁行為機制可能是通過抑制TLR2/4 信號通路激活，并下調(diào)炎性細胞因子的表達，減少炎癥反應。

綜上所述，急性酒精灌胃后24 h、72 h 能引起大鼠抑郁樣行為，電針能改善癥狀，其機制可能是電針抑制TLR2/4、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達。本實驗為臨床治療酒精導致的異常行為改變提供實驗依據(jù)，未來研究有待進一步闡明電針和酒精作用的中樞機制，明確炎性細胞因子的來源通路。

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