曾 艷，李 波，楊 俊，夏夢青，朱曉萍＊＊

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 兒科，貴州 貴陽 550004)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)在兒童中的患病率呈逐年上升趨勢［1］，該病是一種慢性氣道炎癥性疾病，由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與，以氣道炎癥和氣道重塑為主要病理特征，慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性相關(guān)，氣道高反應(yīng)性可導(dǎo)致反復(fù)喘息發(fā)作、呼吸困難、胸悶和咳嗽(尤其是在夜間和凌晨)。白細(xì)胞介素-17(IL-17)是一種前炎性細(xì)胞因子，是T 淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的早期啟動(dòng)因素，能誘導(dǎo)和激活中性粒細(xì)胞在呼吸道的募集，為明確IL-17 基因與貴陽地區(qū)兒童哮喘的相關(guān)性，本研究采用病例對(duì)照的方法、PCR-RFLP 技術(shù)檢測技術(shù)，探討IL-17A基因-152G/A 位點(diǎn)的多態(tài)性及其與貴陽地區(qū)兒童哮喘發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

哮喘組為2012 年11 月～2015 年1 月確診支氣管哮喘的患兒224 例，符合兒童支氣管哮喘診斷與防治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，男152 例，女72 例，平均(6.11±3.27)歲。對(duì)照組為同期門診健康體檢兒童150 例，男93 例，女57 例，平均(5.61±3.55)歲，對(duì)照組兒童均排除哮喘病史、家族哮喘、過敏性疾病史和其他過敏性疾病史。兩組兒童均在貴陽居住半年以上，采血前4 周內(nèi)未靜脈使用糖皮質(zhì)激素，且均無血緣關(guān)系。

1.2 主要儀器及試劑

Eppendorf 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(德國艾本德公司)，BeckmanDU640 型核酸蛋白分析儀(Beckman 公司)，G:BOX 凝膠成像系統(tǒng)(基因有限公司)，DNA 提取試劑盒和2×Taq PCR MasterMix［天根生化科技(北京)有限公司］，引物合成(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，PdmⅠ內(nèi)切酶(賽默飛世爾科技)，500 bp DNAMarker［寶生物工程(大連)有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 全血DNA 提取 取空腹靜脈血3 mL，4 ℃靜置2 h，血凝塊用DNA 提取試劑盒(離心柱型，DP335)提取全血DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 參照GeneBank 中人IL-17A DNA 序列編號(hào)(NC_000006.12)，根據(jù)rs2275913在美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站上查詢-152G/A 位點(diǎn)的基因序列，參考文獻(xiàn)［3－4］確定突變位點(diǎn)，用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。

1.3.3 IL-17A 基因-152G/A 位點(diǎn)PCR-RFLP 檢測

上游引物序列為5'-CAG AAG ACC TAC ATG TTA CT-3'，下游引物序列為5'-GTA GCG CTA TCG TCT CTC T-3'。PCR 目的片段擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系:25 μL 反應(yīng)體系含2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μL，50 mg/L DNA模板2 μL，ddH2O 8.9 μL。PCR 反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共30 次循環(huán)，72 ℃最后一次延伸5 min，反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠水平電泳判斷是否擴(kuò)增成功。擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析:15 μL酶切體系含PCR 產(chǎn)物5 μL，10×FastDigest Green Buffer 1 μL，限制性內(nèi)切酶PdmⅠ(FastDigest PdmⅠ)0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，置于37 ℃恒溫水浴箱反應(yīng)5 min，轉(zhuǎn)至65 ℃恒溫水浴箱5 min 使酶失活，酶切結(jié)果用2%瓊脂糖凝膠水平電泳后采用G:BOX 凝膠成像系統(tǒng)鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，樣本分布經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，檢驗(yàn)樣本群體代表性;計(jì)數(shù)資料用百分比表示，病例組和對(duì)照組的基因型及等位基因頻率分布的差異用χ2檢驗(yàn)分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17A 基因-152G/A 位點(diǎn)

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果顯示哮喘組和對(duì)照組均擴(kuò)增出344 bp 目的片段，見圖1。哮喘組和對(duì)照組PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PdmⅠ酶切后均發(fā)現(xiàn)AA、AG、GG3 種基因型，AA 基因型為213 bp、131 bp，AG 基因型為344 bp、213 bp、131 bp，GG 基因型為344 bp。見圖2。

圖1 哮喘組和對(duì)照組IL-17A-152G/A位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of the-152G/A site of IL-17A gene

圖2 IL-17A 基因-152G/A 位點(diǎn)不同基因型PCR 產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果Fig.2 Enzyme digestion electrophoresis of PCR products of different genotypes of IL-17A gene-152G/A site

2.2 IL-17A 基因-152G/A 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布

哮喘組和對(duì)照組經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢測示均具有群體代表性(表1)，在性別、年齡上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.364，t =1.388，P ＞0.05)。兩組間基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.832，P =0.020)，經(jīng)χ2分割檢驗(yàn)，AA 基因型與AG 基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.395，P=0.036，OR=1.929，95%CI=1.038 ～3.588)，AA 基因型與GG 基因型頻率分布差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.826，P=0.005，OR=2.571，95%CI=1.315 ～5.029)，AG 基因型與GG基因型頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.426，P=0.232);兩組間等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.635，P =0.01，OR=1.477，95%CI=1.097 ～1.988);變異等位基因A 與哮喘關(guān)聯(lián)，A 基因攜帶者患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)高于非攜帶者，尤以突變純合子AA 為著。見表1。

表1 哮喘組和對(duì)照組被檢兒童IL-17A 基因-152G/A 位點(diǎn)基因型及等位基因分布Tab.1 Characteristics of the genotype and allele frequencies of IL-17A gene-152G/A site of children in asthma group and control group

3 討論

Th17 細(xì)胞是Park 于2005 年在對(duì)兩種自身免疫疾病動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的研究過程中發(fā)現(xiàn)的一類不同于Th1 和Th2 的CD4+Th 亞群細(xì)胞［5］，可以誘導(dǎo)組織發(fā)生強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)的T 細(xì)胞亞群［6］，可以通過多種途徑參與哮喘的發(fā)生發(fā)展，其效應(yīng)因子IL-17 與哮喘等疾病明顯相關(guān)［7］。IL-17 通過促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟，刺激相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎性介質(zhì)和趨化細(xì)胞因子等，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生［8］，活化的IL-17 還可激活上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，釋放粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IL-1、IL-6 和IL-8 等，不僅促進(jìn)氣道炎癥的進(jìn)一步加劇，還能參與氣道的重構(gòu)。氣道重塑病理基礎(chǔ)包括氣道上皮細(xì)胞和平滑肌增生，粘液高度分泌，上皮下組織纖維化，以及血管生成［9］。

研究表明，IL-17A 基因的單核苷酸多態(tài)性與多種疾病相關(guān)，尤其是自身免疫性疾病［10］。一項(xiàng)日本研究報(bào)道，rs2275913 位點(diǎn)(-152G/A)位于IL-17A 啟動(dòng)子區(qū)域，可調(diào)控IL-17 表達(dá)，A 等位基因可增強(qiáng)啟動(dòng)子活性并增強(qiáng)啟動(dòng)子與核轉(zhuǎn)錄因子活化T 淋巴細(xì)胞核因子的結(jié)合能力，促進(jìn)IL-17 表達(dá)［11］?；騼?nèi)部的單核苷酸多態(tài)性直接或間接影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平或性質(zhì)，從而導(dǎo)致遺傳易感性。

Nordang 等［12］對(duì)挪威和新西蘭的高加索人進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在IL-17A 的5 個(gè)SNP 多態(tài)性基因位點(diǎn)中rs2275913 與挪威人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)，而與新西蘭的高加索人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎卻沒有明顯相關(guān)性。Arisawa 等［13］對(duì)日本UC 患者IL-17A/F 基因多態(tài)性的分析中認(rèn)為，rs2275913 和rs763780 的基因多態(tài)性均與UC 的患病相關(guān)。

本研究結(jié)果示哮喘組及對(duì)照組均存在野生型(GG)、雜合子型(AG)及突變型(AA)三種基因型，基因型及等位基因頻率在兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，發(fā)現(xiàn)IL-17A 基因-152G/A 位點(diǎn)多態(tài)性與貴陽地區(qū)兒童哮喘發(fā)病存在相關(guān)性，A 等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，可能增加兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)G 突變?yōu)锳 時(shí)，患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)是健康兒童的1.477倍，尤其以突變純合子AA 基因型較其他基因型更易患哮喘，為其它基因型的2.134 倍(χ2=6.376，P =0.012，OR=2.134，95%CI=1.174 ～3.877);Chen J 等［3］對(duì)IL-17A rs2275913 位點(diǎn)基因型頻率檢測中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)和哮喘相關(guān)，純合子A 的兒童患哮喘的幾率是其他基因型的2.29 倍，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但Wang 等［14］對(duì)臺(tái)灣地區(qū)漢族哮喘兒童IL-17A 基因多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的研究中發(fā)現(xiàn)－152A/G 位點(diǎn)與該地區(qū)哮喘發(fā)病無關(guān);王娟等［15］研究發(fā)現(xiàn)IL-17A 基因rs711998 可能是兒童哮喘易感位點(diǎn)，其中該位點(diǎn)GG 純合子基因型與哮喘發(fā)病密切相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)IL-17A rs2275913 多態(tài)性與哮喘發(fā)病有相關(guān)性，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。哮喘是一種復(fù)雜的多基因遺傳傾向的疾病，人體中基因與基因之間有著相互作用及累積效應(yīng)，環(huán)境因素，在兒童中如被動(dòng)吸煙、空氣中的塵螨、寵物毛屑等均可影響哮喘的易感性，這些均可造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。

綜上所訴，IL-17A 基因-152G/A 位點(diǎn)可能是貴陽地區(qū)兒童哮喘的候選基因，目前指南推薦的吸入性激素(ICS)治療雖能有效控制嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的氣道炎癥，但對(duì)中性粒細(xì)胞炎癥及氣道重塑無效，IL-17 作為促進(jìn)哮喘中性粒細(xì)胞炎癥的重要因子，與哮喘氣道重塑關(guān)系密切，有望成為防治哮喘的新靶點(diǎn)。進(jìn)行哮喘易感基因的多態(tài)性的檢測，希望能早期從基因水平篩選哮喘易感人群，以便早期診斷、干預(yù)及治療。

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