楊　星，黃　睿，梁曉燕(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州510610)

PCOS患者卵泡液微環(huán)境中的亞急性炎癥反應(yīng)*

楊星，黃睿，梁曉燕△
(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州510610)

［摘要］目的:回顧性分析多囊卵巢綜合征(PCOS)患者及對(duì)照者卵泡液微環(huán)境中局部脂代謝紊亂及炎癥反應(yīng)狀態(tài)及其形成機(jī)制。方法:比較2組患者外周血清脂代謝指標(biāo)、性激素、炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)水平差異;測(cè)定卵泡液中炎癥介質(zhì)及載脂蛋白含量;分析卵巢顆粒細(xì)胞中炎癥介質(zhì)及載脂蛋白基因表達(dá)。結(jié)果: PCOS患者具備典型肥胖、高脂血癥及高雄激素血癥，外周血中炎癥細(xì)胞及各類炎癥介質(zhì)水平顯著增加;卵泡液中同樣具有顯著增加的炎癥細(xì)胞因子浸潤(rùn)，顆粒細(xì)胞內(nèi)炎癥介質(zhì)及載脂蛋白基因表達(dá)增加。結(jié)論: PCOS組患者卵泡液內(nèi)所含高水平載脂蛋白表明卵泡液內(nèi)可能存在高脂蛋白狀態(tài)。循環(huán)中的高脂血癥及亞急性炎癥各類因子可能通過(guò)血清-卵泡液屏障主動(dòng)滲透。顆粒細(xì)胞通過(guò)主動(dòng)攝取(例如載脂蛋白A)抑或自主合成(如炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α等)等多種方式進(jìn)行卵泡液局部微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。卵子發(fā)育生理性卵泡液微環(huán)境的脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、高雄激素血癥等均可能影響到卵母細(xì)胞和胚胎的正常發(fā)育。

［關(guān)鍵詞］多囊卵巢綜合征;肥胖;亞急性炎癥反應(yīng);卵泡液

［修回日期］2015-06-18

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是育齡期婦女最常見的內(nèi)分泌疾病之一，發(fā)病率達(dá)6～10%［1］。臨床表現(xiàn)通常包括肥胖、高雄激素血癥、慢性無(wú)排卵、多囊樣卵巢、多毛、不孕和妊娠期間的并發(fā)癥增加。多囊卵巢綜合征本身是一類炎癥前狀態(tài)。大量研究表明PCOS患者血循環(huán)中致病性炎癥調(diào)節(jié)因子顯著增加［2］。PCOS婦女中約有38%～66%是肥胖者［3］。肥胖本身亦是一種慢性全身性炎癥狀態(tài)，脂肪細(xì)胞是機(jī)體重要的內(nèi)分泌器官，可以分泌一系列的生物活性物質(zhì)如脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、白細(xì)胞介素等，對(duì)促進(jìn)炎癥狀態(tài)有重要作用［2］。肥胖者存在外周血炎性細(xì)胞因子水平增加以及外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的改變［4］。各類因子分泌狀態(tài)的改變可能會(huì)引起PCOS患者一系列病理狀態(tài)產(chǎn)生。肥胖或多囊卵巢各自對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量和生育結(jié)局的影響是復(fù)雜的，且受多種因素影響。PCOS患者循環(huán)中炎性因子水平增加這種改變根源于PCOS本身，亦或是歸因于肥胖或腹部脂肪堆積尚未完全明確。

卵巢中卵泡液是卵子生長(zhǎng)發(fā)育的生理性環(huán)境，卵子的生長(zhǎng)發(fā)育，選擇及主導(dǎo)化過(guò)程均在卵泡液微環(huán)境中完成。卵泡液與血清之間存在血清-卵泡液屏障，具有一定的調(diào)節(jié)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的能力。卵泡液微環(huán)境中具有源于血清的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提供卵子發(fā)育所需的能量底物，同時(shí)卵泡液中各類類固醇激素，垂體激素、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的濃度關(guān)系到卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、受精率和早期胚胎發(fā)育潛能。被主導(dǎo)化而選擇的卵子其質(zhì)量及發(fā)育潛能都與卵巢內(nèi)及卵泡微環(huán)境中的細(xì)胞因子密切相關(guān)。

由于中國(guó)人更傾向于在較低的體重指數(shù)(body mass index，BMI)水平伴隨脂質(zhì)代謝異常風(fēng)險(xiǎn)［5］，PCOS伴隨脂質(zhì)代謝異常如何改變卵泡液微環(huán)境穩(wěn)態(tài)研究匱乏。我們遂采用回顧性分析的辦法，納入進(jìn)行輔助生育助孕治療的PCOS患者及對(duì)照人群作為研究對(duì)象，測(cè)定并分析PCOS患者卵泡液微環(huán)境中局部脂代謝紊亂及炎癥反應(yīng)狀態(tài)，及探討其形成機(jī)制。

材料和方法

1研究對(duì)象

本研究納入在中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖中心進(jìn)行助孕治療的患者共96名。其中包括符合2003年鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)的PCOS患者46名，以及年齡介于20～35歲、相匹配的對(duì)照組患者50名。對(duì)照組患者月經(jīng)周期規(guī)則，BMI≤22 kg/m2，正常卵巢儲(chǔ)備，由于盆腔輸卵管因素或男方因素接受體外受精-胚胎移植治療。

2血清標(biāo)本收集

月經(jīng)期獲取空腹血清，羅氏電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定基礎(chǔ)性激素水平，包括卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、睪酮(testosterone，T) ;同時(shí)測(cè)定甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，CH)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)、載脂蛋白A(apolipoprotein A，ApoA)和ApoB; ELISA測(cè)定血清超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)等炎癥介質(zhì)水平。

3人類卵泡液收集及檢測(cè)

獲取行體外受精-胚胎移植治療患者取卵時(shí)第一管清亮卵泡液4 000 r/min離心10 min后保存于－80℃。將卵泡液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用無(wú)菌PBS洗2次，1 000 r/min離心5 min。用PBS重懸細(xì)胞，以1∶1體積緩慢加至50% Ficoll液，2 500 r/min離心20 min?？梢娭虚g白色云霧狀顆粒細(xì)胞團(tuán)，管底紅細(xì)胞沉淀。吸取中間細(xì)胞層至新離心管，加入等量PBS洗1次。1 000 r/min離心5 min。棄上清。沉淀顆粒細(xì)胞保存于－80℃。后續(xù)進(jìn)行卵泡液內(nèi)炎癥細(xì)胞因子(IL-6、IL-1、TNF-α)及載脂蛋白(ApoA-I、Apo-AII、ApoB、ApoC、ApoE)含量測(cè)定。

4顆粒細(xì)胞內(nèi)炎癥介質(zhì)及載脂蛋白mRNA檢測(cè)

使用Qiagen公司RNeasy Micro Kit提取顆粒細(xì)胞中的RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。所測(cè)定的炎癥介質(zhì)包括ApoA、ApoB、ApoE、IL-1、TNF-α及IL-6。于Rotor-GeneTM6000 (Corbett Research)進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。采用2－ΔΔCt方法定量分析基因表達(dá)。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用非配對(duì)t檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism 5.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 PCOS患者血清中激素及代謝指標(biāo)的變化

與對(duì)照組相比，PCOS組患者的BMI顯著增加，其中BMI達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)者(BMI≥25 kg/m2) 19名，正常BMI者27名?；A(chǔ)性激素具有典型的PCOS特征，即顯著增高的LH及睪酮水平，見表1。PCOS患者BMI的增高伴隨著外周血中甘油三酯及ApoB水平的顯著增加，而其余各類載脂蛋白及膽固醇脂與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表1　患者一般情況及基礎(chǔ)性激素水平Table 1.The general characteristics and the levels of the gonadal hormones (Mean±SEM)

表2　外周血脂代謝指標(biāo)Table 2.The indexes of lipid metabolism in peripheral blood (Mean±SEM)

2PCOS患者外周血的亞急性炎癥狀態(tài)

血液分析細(xì)胞計(jì)數(shù)提示PCOS患者外周血中存在顯著增加的亞急性炎癥反應(yīng)，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞、數(shù)量均有顯著增加。與此相伴隨的是異常增高的血清炎癥細(xì)胞因子，如hs-CRP、TNF-α及IL-6，見表3。

3 PCOS患者卵泡微環(huán)境中的亞急性炎癥介質(zhì)水平

PCOS患者卵泡液中的載脂蛋白ApoA及ApoB顯著高于對(duì)照組，ApoC及ApoE水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)卵泡液中同樣存在高水平的炎癥細(xì)胞因子IL-1及IL-6，TNF-α同樣在PCOS患者中具有增高趨勢(shì)，但差異不顯著，見圖1。

表3　外周血炎急性亞癥反應(yīng)指標(biāo)Table 3.The subate inflammation indexes in peripheral blood(Mean±SEM)

Figure 1.The lipid metabolism index and inflammatory cytokine levels in the follicular fluid.ApoA-I，ApoA-II，ApoB，IL-6 and IL-1 levels were significantly increased in the obese PCOS patients.Mean±SEM.n=20.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖1卵泡液中脂質(zhì)代謝指標(biāo)及炎癥細(xì)胞因子水平的變化

4 PCOS患者卵泡液微環(huán)境中的炎癥介質(zhì)基因表達(dá)異常

與卵泡液中增高的炎癥細(xì)胞因子水平相對(duì)應(yīng)的是PCOS患者卵巢組織內(nèi)顆粒細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6及TNF-α的mRNA表達(dá)增加。載脂蛋白ApoB表達(dá)增加，而ApoA及ApoE的mRNA表達(dá)差異不顯著，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of lipid metabolism index and inflammation cytokine genes in the granulose cells.The mRNA levels of ApoB，IL-1，IL-6 and TNF-α were highly expressed in the granulose cells from obese PCOS group.Mean±SEM.n=9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2卵巢組織顆粒細(xì)胞內(nèi)脂代謝及炎癥細(xì)胞因子相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

討論

本研究所納入的PCOS患者平均BMI達(dá)到23.59 kg/m2，已經(jīng)達(dá)到亞洲人種超重的標(biāo)準(zhǔn)［5］，具有典型高血脂及高雄激素血癥的內(nèi)分泌紊亂狀態(tài)。既往大量研究表明，肥胖婦女血清代謝指標(biāo)紊亂，導(dǎo)致血清膽固醇和非酯化脂肪酸濃度增高，出現(xiàn)高血糖和胰島素抵抗［6］。血清代謝變化可反映在卵泡液中，肥胖婦女的卵泡液內(nèi)含有高水平的甘油三酯及脂肪酸。肥胖婦女卵泡液組成成分的改變可能會(huì)影響卵母細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞成熟過(guò)程及質(zhì)量［7-8］，導(dǎo)致胚胎生理特征異常例如葡萄糖耐受不良和胚胎基因表達(dá)模式發(fā)生改變，可能減少胚胎植入率及隨后增加發(fā)育異常的潛在風(fēng)險(xiǎn)［9-10］。這些對(duì)生育的不良風(fēng)險(xiǎn)同樣存在于本研究所納入的PCOS患者中。

本研究測(cè)定了兩組患者血清及卵泡液中炎癥指標(biāo)，提示PCOS患者外周血中慢性炎癥指標(biāo)hs-CRP及各類炎癥細(xì)胞數(shù)量增加，其中單核細(xì)胞主要來(lái)源方式是機(jī)體堆積的脂肪組織，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞形成并分泌各類炎癥性細(xì)胞因子，炎癥介質(zhì)反過(guò)來(lái)進(jìn)一步刺激脂肪組織細(xì)胞因子以旁分泌的方式產(chǎn)生。PCOS患者血清中及卵泡液中炎癥細(xì)胞因子水平均可見顯著增加，一方面可能存在炎癥因子通過(guò)血清-顆粒細(xì)胞屏障自循環(huán)中滲透進(jìn)入，但更重要的是我們發(fā)現(xiàn)PCOS患者中卵巢顆粒細(xì)胞各類炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)顯著增加，可能是由于血循環(huán)中增多的炎癥細(xì)胞包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等在卵巢組織、卵泡內(nèi)局部浸潤(rùn)增加［11］，顆粒細(xì)胞局部炎癥介質(zhì)基因表達(dá)升高，合成過(guò)程增加。PCOS的高雄激素血癥增加單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞對(duì)血糖的敏感性，促進(jìn)單核細(xì)胞的激活過(guò)程，促進(jìn)卵泡液微環(huán)境中單核細(xì)胞生成釋放亞急性炎癥因子TNF-α及IL-6。而局部TNF-α增高可能促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增生，促進(jìn)卵巢卵泡膜細(xì)胞的雄激素生產(chǎn)，進(jìn)一步形成循環(huán)圈不斷激發(fā)亞急性炎癥反應(yīng)過(guò)程。各類細(xì)胞因子形成關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)交互作用，某一特定細(xì)胞因子的作用效果也許并不單純與其絕對(duì)濃度相關(guān)。該因子自身效果與誘導(dǎo)其它因子表達(dá)形成平衡狀態(tài)。

載脂蛋白主要在肝臟合成，運(yùn)載脂類物質(zhì)及穩(wěn)定脂蛋白結(jié)構(gòu)。卵泡液中ApoB濃度代表卵泡液中LDL成分多少，是對(duì)血循環(huán)中潛在的高脂蛋白血癥的反映。另一方面，卵泡在最終成熟過(guò)程中，各類類固醇激素的合成及變化顯著，膽固醇是激素合成的重要底物，也是卵子成熟并卵裂過(guò)程所需細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)。有報(bào)道稱，載脂蛋白與膽固醇結(jié)合可能對(duì)保護(hù)卵子質(zhì)量及后續(xù)胚胎發(fā)育潛能有益，降低胚胎碎片［12］。成熟卵泡液中的顆粒細(xì)胞也可能存在從血清中主動(dòng)攝取載脂蛋白的過(guò)程。

綜上所述，PCOS患者卵泡液內(nèi)所含高水平載脂蛋白A是卵泡液內(nèi)高脂蛋白狀態(tài)的直接反映。循環(huán)中的高脂血癥及亞急性炎癥各類指標(biāo)可以通過(guò)血清-卵泡液屏障滲透進(jìn)入卵泡液微環(huán)境，而顆粒細(xì)胞局部同樣也可能同時(shí)存在主動(dòng)攝取(如ApoB)抑或是自主生成增加(如炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α等)等多種方式進(jìn)行卵泡液局部微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。卵子及后續(xù)胚胎對(duì)于自身卵泡液微環(huán)境改變易感，該生理性微環(huán)境的脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、高雄激素血癥等均可能影響到卵母細(xì)胞和胚胎的正常發(fā)育。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Norman RJ，Wu R，Stankiewicz MT.4: Polycystic ovary syndrome［J］.Med J Aust，2004，180(3) : 132-137.

［2］Samy N，Hashim M，Sayed M，et al.Clinical significance of inflammatory markers in polycystic ovary syndrome: their relationship to insulin resistance and body mass index ［J］.Dis Markers，2009，26(4) : 163-170.

［3］Glueck CJ，Dharashivkar S，Wang P，et al.Obesity and extreme obesity，manifest by ages 20-24 years，continuing through 32-41 years in women，should alert physicians to the diagnostic likelihood of polycystic ovary syndrome as a reversible underlying endocrinopathy［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2005，122(2) : 206-212.

［4］O’Rourke RW，Kay T，Lyle EA，et al.Alterations in peripheral blood lymphocyte cytokine expression in obesity ［J］.Clin Exp Immunol，2006，146(1) : 39-46.

［5］WHO Expert Consultation.Appropriate body-mass index for Asian populations and its implications for policy and intervention strategies［J］.Lancet，2004，363(9403) : 157-163.

［6］Lebovitz HE.Insulin resistance: a common link between type 2 diabetes and cardiovascular disease［J］.Diabetes Obes Metab，2006，8(3) : 237-249.

［7］Valckx SD，De Pauw I，De Neubourg D，et al.BMI-related metabolic composition of the follicular fluid of women undergoing assisted reproductive treatment and the consequences for oocyte and embryo quality［J］.Hum Reprod，2012，27(12) : 3531-3539.

［8］Robker RL，Akison LK，Bennett BD，et al.Obese women exhibit differences in ovarian metabolites，hormones，and gene expression compared with moderate-weight women ［J］.J Clin Endocrinol Metab，2009，94(5) : 1533-1540.

［9］Van Hoeck V，Sturmey RG，Bermejo-Alvarez P，et al.Elevated non-esterified fatty acid concentrations during bovine oocyte maturation compromise early embryo physiology ［J］.PLoS One，2011，6(8) : e23183.

［10］Brewer CJ，Balen AH.The adverse effects of obesity on conception and implantation［J］.Reproduction，2010，140(3) : 347-364.

［11］Xiong YL，Liang XY，Yang X，et al.Low-grade chronic inflammation in the peripheral blood and ovaries of women with polycystic ovarian syndrome［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2011，159(1) : 148-150.

［12］Browne RW，Shelly WB，Bloom MS，et al.Distributions of high-density lipoprotein particle components in human follicular fluid and sera and their associations with embryo morphology parameters during IVF［J］.Hum Reprod，2008，23(8) : 1884-1894.

(責(zé)任編輯:林白霜，羅森)

Subacute inflammatory reaction in follicular fluid of Chinese PCOS patients

YANG Xing，HUANG Rui，LIANG Xiao-yan
(Reproductive Medicine Centre，The Sixth Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510610，China.E-mail: lxyzy@263.net)

［ABSTRACT］AIM: To retrospectively analyze the lipid metabolism disturbance and subacute inflammation within the microenvironment of follicular fluid between Chinese polycystic ovarian syndrome (PCOS) patients and the controls.METHODS: Serum lipid indexes，steroid hormone levels，and inflammatory cell counts were analyzed.The inflammatory cytokine and apolipoprotein levels were detected in the serum and follicular fluid.The mRNA expression of apolipoproteins and cytokines in the granulose cells was determined by real-time PCR.RESULTS: PCOS patients showed typical obesity accompanied with hyperlipidemia and hyperandrogenemia.Significantly elevated inflammatory cell number and cytokine levels were detected in both serum and follicular fluid.The mRNA expression levels of the inflammatory cytokines and apolipoproteins in the granulose cells from the PCOS patients were higher than those from the controls.CONCLUSION: Elevated apolipoproteins reflect systematic hyperlipidemia in the follicular fluid.Serum lipids and cytokines penetrate follicle-serum barrier and get into follicle fluid.Meanwhile，increased intake of apolipoproteins or elevated synthesis of cytokines (IL-1，IL-6 and TNF-α) by granulose cells could also be crucial to stabilize microenvironment of follicular fluid.Oocyte and subsequent embryos are sensitive to the originaal follicular environment.The lipid metabolism disturbance，inflammatory cell infiltration and hyperandrogenemia may possibly disturb oocyte developmental potential.

［KEY WORDS］Polycystic ovarian syndrome; Obese; Subacute inflammatory reaction; Follicular fluid

通訊作者△Tel: 020-38048013; E-mail: lxyzy@263.net

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81100401; No.81470063) ;廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014A030313129)

［收稿日期］2015-06-01

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1652-05

［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.022