呂海燕,劉傳杰,黃建華

(解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所免疫研究室,北京 100853)

結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率在世界范圍逐年增高。由于其潛在的臨床表現(xiàn)和早期癥狀的非特異性,40%～50%的新病例被診斷時已屬晚期,導致手術(shù)治愈率低[1]。對于晚期結(jié)直腸癌患者尤其是老年患者,常規(guī)化療在一定程度上雖可觀察到療效,卻不能有效地提高整體生存率。此外,化療的多重不良反應(yīng)會嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。因此迫切需要確定新的針對結(jié)直腸癌的有效治療策略。

越來越多的證據(jù)表明[3-5],治療腫瘤需要創(chuàng)建有效靶向殺滅腫瘤干細胞的新策略。到目前為止,所發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細胞特異性標志物非常稀少,而CD133則是目前所發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞中最常見的標志物之一[6]。由此我們選定了CD133作為針對CD133陽性結(jié)直腸癌治療研究的新靶點。

本研究擬進行抗體與細胞因子活化殺傷(cytokine-induced killer,CIK)免疫細胞治療技術(shù)的融合與創(chuàng)新,構(gòu)建抗CD133/CD3雙功能特異性抗體裝備的CIK細胞作為效應(yīng)細胞,為開展靶向治療高表達CD133人結(jié)直腸癌的可行性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞

人結(jié)直腸癌細胞株SW620、HT29和LOVO均購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC),并于本實驗室保存。

1.2 試劑

無血清細胞培養(yǎng)基(RPMI1640;GIBCO公司,美國);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;HyClone公司,新西蘭);鼠抗人CD3單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb;TaKaRa公司,日本);鼠抗人CD133-PE抗體和抗CD133(AC133)mAb(美天旎生物技術(shù)公司,德國);鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標熒光標記抗體和同型對照IgG1(BD公司,美國);Traut’s試劑和4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(SULFO-SMCC)試劑(賽默飛世爾科技公司,美國);人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責任公司);細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK8;DojinDo公司);PD-10脫鹽層析柱(安瑪西亞公司,瑞典);人IFN-γ ELISA試劑盒(R＆D抗體公司,美國)。

1.3 CIK細胞的培養(yǎng)

取健康志愿者外周靜脈血10ml,肝素抗凝,用生理鹽水1∶1稀釋后,加至淋巴細胞分離液上層,離心收集外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用含6%自體血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為2×106個/ml,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,加入鼠抗人CD3mAb(50ng/ml)和人重組白介素-2(1000U/ml),每2d加液補充人重組白介素-2,14d后,流式檢查細胞表型(CD3、CD4、CD8和CD56)后收獲CIK細胞。

1.4 CIK細胞表型的檢測

將培養(yǎng)0d和14d的CIK細胞調(diào)整濃度為5×106個/ml,各取200μl加入Falcon管中,加入鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標抗體及同型對照IgG1單抗各5μl,混勻,在4℃暗室反應(yīng)30 min后,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次,流式細胞儀檢測。

1.5 抗CD133/CD3雙特異性抗體的制備

我們按照文獻[7]方法制備雙特異性抗體。取鼠抗人CD3mAb(OKT3抗體)1mg溶于5倍摩爾濃度的Traut’s試劑500μl,室溫下作用1h,用PD-10柱過濾,移除未交聯(lián)的mAb;取鼠抗人CD133mAb(1mg)溶于4倍摩爾濃度的交聯(lián)劑SULFO-SMCC500ul,室溫下作用1h,用PD-10柱過濾,移除未交聯(lián)的mAb;將已交聯(lián)的兩種mAb混合后4℃過夜,制備得到抗CD133/CD3雙功能特異性抗體。雙抗體蛋白產(chǎn)物通過8%非還原、變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖、考馬斯亮藍染色檢測后,用蛋白定量BCA試劑盒檢測雙抗的蛋白含量。

1.6 抗CD133/CD3雙特異性抗體裝載CIK細胞

離心收集培養(yǎng)14d并經(jīng)表型檢測過的CIK細胞,PBS洗滌2次,按1×106個CIK/50ng雙抗?jié)舛燃尤肟笴D133/CD3雙功能特異性抗體,混勻后室溫靜置60min,PBS洗滌沒有結(jié)合上的抗體,CIK重懸培養(yǎng)液中,按一定比例加入靶細胞培養(yǎng)液中,得到抗CD133/CD3雙特異性抗體裝載的CIK(BsAb-CIK)細胞。

1.7 細胞毒作用的檢測

以CIK細胞為效應(yīng)細胞,以人結(jié)直腸癌細胞系SW620、HT29和LOVO作為靶細胞,檢測對比BsAb-CIK細胞的殺傷作用。用健康供者的CIK細胞分別對SW620、HT29和LOVO細胞進行體外殺傷實驗。

取對數(shù)生長期腫瘤細胞,鋪96孔細胞培養(yǎng)板(10000個/孔),第2天分別加入CIK細胞或BsAb-CIK細胞(1×106個/50ng),以效靶比1∶1、5∶1、10∶1和20∶1的濃度(3個平行孔/濃度)共同培養(yǎng)4～6h,實驗同時設(shè)單純CIK細胞對照組、靶細胞對照組和空白組。棄上清液,PBS漂洗細胞2次后,加入CCK8細胞計數(shù)試劑盒中繼續(xù)培養(yǎng)4h,96孔細胞培養(yǎng)板放入酶聯(lián)儀檢測450nm處吸光度A，根據(jù)公式計算細胞殺傷作用：殺傷率（%）＝[1-A實驗組/（ACIK對照＋A靶細胞對照）]×100%。

1.8 細胞因子檢測

取對數(shù)生長期人結(jié)直腸癌細胞系SW620、HT29和LOVO，鋪96孔細胞培養(yǎng)板（10 000個/孔），第2天加入CIK細胞或BsAb-CIK細胞，以效靶比1∶1、5∶1、10∶1和20∶1的濃度共同培養(yǎng)4～6h后，收集上清液，用ELISA試劑盒檢測細胞INF-γ分泌水平。

1.9 裸鼠荷瘤制備實驗

6～8周齡雌裸鼠27只，隨機分成3組：對照組、單純CIK組和BsAb-CIK細胞組。每只裸鼠右腋下皮下注射2×106個人結(jié)直腸癌細胞系SW620或HT29細胞，10d后腫瘤長到約0.3cm×0.3cm×0.17cm大小，治療組分別在每只裸鼠腹腔內(nèi)注射CIK或BsAb-CIK細胞1×107個，6d后再次注射相同數(shù)量細胞，共2次。1個月后處死小鼠取瘤秤重，統(tǒng)計3組間腫瘤生長的差異。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)后的CIK細胞表型

結(jié)果表明在多種細胞因子的誘導下，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)14d的細胞與0d的細胞比較，CD8+/CD56+由2.65%升至11.70%，CD3+/CD8+由28.50%升至67.21%，CD3+/CD56+由3.16%升至15.92%，其中CD3+/CD8+和CD3+/CD56+細胞比率明顯升高，表明CIK細胞主要成分是具有殺傷作用的淋巴細胞，包括T細胞和NKT細胞（圖1）。

2.2 構(gòu)建抗CD133和抗CD3的雙特異性功能抗體

在溫和的條件下將小鼠抗人CD133和CD3mAb進行化學偶聯(lián)，制備抗CD133/CD3雙特異性抗體。通過8%非還原、變性SDS-PAGE蛋白電泳檢測，證實抗CD133/CD3兩種抗體偶聯(lián)的二聚體蛋白條帶為300kD，而單體為150kD（圖2）。

2.3 結(jié)直腸癌腫瘤細胞中CD133的表達

通過流式細胞儀對7種結(jié)直腸癌細胞株的CD133表面抗原進行檢測，篩選出高、低表達CD133的配對細胞株。其中SW620表達CD133的陽性率為99.43%，HT29為66.67%，LOVO為2.92%（圖3）。

2.4 BsAb-CIK細胞體外殺傷CD133高表達結(jié)直腸癌細胞系

用CCK8試劑盒檢測細胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同效靶比條件下（1∶5，1∶10，1∶20），BsAb-CIK細胞對高表達CD133的結(jié)直腸癌細胞系SW620和HT29的殺傷作用均明顯高于單純CIK組（P＜0.05），而BsAb-CIK細胞對低表達CD133的結(jié)直腸癌細胞系LOVO的殺傷作用與單純CIK組相比，沒有顯著性差異（P＞0.05）。無論是CIK細胞還是BsAb-CIK細胞，其殺傷靶細胞的作用與效應(yīng)細胞的濃度均呈正相關(guān)（圖4）。

圖1 培養(yǎng)0d和14d的健康人CIK細胞表型Figure 1 The phenotype of the CIK cells from the healthy individual on day 0 and day 14

圖2 CD133/CD3兩種抗體偶聯(lián)的二聚體蛋白Figure 2 Production of anti-CD3/ anti-CD133 BsAb

2.5 細胞因子INF-γ的分泌水平

各組培養(yǎng)上清中細胞因子均伴有INF-γ分泌水平明顯增高，BsAb-CIK細胞與單純CIK組比較差異顯著（P＜0.05；圖5）。表明BsAb-CIK細胞對靶細胞的殺傷效應(yīng)與INF-γ分泌水平密切相關(guān)。

2.6 BsAb-CIK細胞對裸鼠體內(nèi)移植瘤的殺傷

經(jīng)統(tǒng)計學分析表明，與單純CIK治療組比較，BsAb-CIK細胞對小鼠SW620和HT29細胞皮下移植瘤的生長抑制作用更加顯著（P＜0.05；表1）。

3 討 論

目前，CD133已經(jīng)確定為結(jié)直腸癌腫瘤干細胞表面標志分子[10,11]。由于直接作用于腫瘤干細胞的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）還沒有問世[12,13]，而單純CIK細胞又不能靶向殺傷腫瘤干細胞，所以我們利用mAb的靶向殺傷作用和CIK細胞所具有的非主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性強大殺瘤活性的特性，構(gòu)建了BsAb-CIK新型效應(yīng)細胞。

圖3 人結(jié)直腸癌細胞系CD133的表達Figure 3 Expression of CD133 in human colorectal cancer cell lines

本研究通過用抗CD133抗體對7種人結(jié)直腸癌腫瘤細胞株的CD133抗原表達的篩查后，選擇了高低配對細胞株作為靶細胞。結(jié)果表明CIK細胞在裝備了抗CD133/CD3雙抗體之后，不僅發(fā)揮了CIK廣譜直接殺傷腫瘤細胞的治療作用，而且利用雙功能抗體的橋聯(lián)作用將效應(yīng)細胞和高表達CD133的腫瘤靶細胞有機地結(jié)合到一起，形成殺傷組合體，發(fā)揮了抗體靶向打擊消滅CD133陽性的腫瘤干細胞的強大作用。雙特異性抗體不僅將效應(yīng)細胞富集在腫瘤周圍，而且可以模擬天然配體的作用，與細胞表面引發(fā)分子結(jié)合，激活效應(yīng)細胞，實現(xiàn)對腫瘤細胞的靶向性的殺傷。由于抗體對抗原的識別不需要抗原提呈及MHC的表達，因此CIK裝載特異性雙抗的治療方案不但能夠有效地解決腫瘤干細胞對宿主免疫監(jiān)視逃逸和耐藥性等影響療效的關(guān)鍵難題，而且能夠修補CIK細胞免疫治療不能消滅具有復發(fā)轉(zhuǎn)移的種子——腫瘤干細胞的缺陷。我們的研究結(jié)果與文獻報道結(jié)果是一致的[14]。由此可以推測BsAb-CIK新型效應(yīng)細胞不僅能夠?qū)D133高表達的結(jié)直腸癌細胞進行高效打擊，而且也有可能對各種腫瘤中的高表達CD133的干細胞細胞亞群進行有效抑制。這一靶向殺傷CD133陽性細胞的治療方案有可能對如何消滅腫瘤干細胞、從源頭上解決腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移、根治腫瘤提供了新的線索與論據(jù)。

我們的實驗發(fā)現(xiàn)BsAb-CIK對靶細胞的殺傷效應(yīng)與INF-γ分泌水平密切相關(guān)。IFN-γ可以促進naiveCD4+T細胞向Th1細胞分化，同時還具有抑制naiveCD4+T向Th2細胞分化的功能，提示了BsAb-CIK細胞是通過增強抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)機制發(fā)揮更強的殺傷腫瘤作用。

總之，我們的研究表明抗BsAb-CIK細胞能夠有效的靶向殺傷CD133高表達的腫瘤細胞。這一研究結(jié)果為創(chuàng)建高效靶向消滅CD133陽性腫瘤干細胞的新型免疫治療策略與方案提供了重要科學論據(jù)，為深入探討增效殺瘤作用機制奠定了基礎(chǔ)。

圖4 CIK和BsAb-CIK細胞殺傷結(jié)直腸癌細胞系Figure 4 The killing effect of CIK and BsAb-CIK cells on the human colorectal cancer cell lines (n＝3)

圖5 CIK組和BsAb-CIK組INF-γ分泌水平Figure 5 Secretion level of INF-γ in CIK group and BsAb-CIK group (n＝3)

表1 各組移植瘤經(jīng)治療后腫瘤瘤重比較Table 1 Comparison of tumor weight after treatment in each group(n＝9, g, ±s)

表1 各組移植瘤經(jīng)治療后腫瘤瘤重比較Table 1 Comparison of tumor weight after treatment in each group(n＝9, g, ±s)

Compared with CIK group, *P＜0.05

Cell line Control group CIK group BsAb-CIK group SW620 3.74±0.09 2.80±0.11 1.54±0.12*HT29 1.42±0.18 0.72±0.23 0.43±0.18*

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