王 帥，包永睿，楊欣欣，王思思，孟憲生*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600)

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基于心肌細胞缺氧/復氧損傷的麥冬多糖提取工藝研究

王 帥1,2,3，包永睿1,2,3，楊欣欣1,2,3，王思思1，孟憲生1,2,3*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600)

目的：優(yōu)化麥冬多糖提取工藝，并驗證其對心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用。方法：采用L9(34)正交試驗，以麥冬多糖含量為考察指標，以溶媒量、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，篩選麥冬多糖最佳提取工藝；單因素實驗，考察其最佳醇沉濃度；在此基礎上，采用體外細胞實驗建立乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，以細胞損傷抑制率為指標，驗證麥冬多糖對心肌細胞的保護作用。結果：麥冬多糖的最佳提取工藝為14倍量的水回流提取3次，每次1 h，醇沉濃度以80%為宜；按此工藝提取的麥冬多糖對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷具有較好的保護作用，但表現(xiàn)出一定的劑量、時間與藥效的非線性關系。結論：本實驗優(yōu)化了麥冬多糖的提取工藝，同時驗證了麥冬多糖對缺氧/復氧損傷型冠心病的治療作用，為揭示其藥效物質基礎與大規(guī)模工業(yè)化生產提供參考。

麥冬；多糖；提取工藝；缺氧/復氧損傷

麥冬原名麥門冬，始載于《神農本草經》，列為上品，為百合科植物麥冬Ophiopogonjaponicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥塊根。甘、微苦，微寒，歸心、肺、胃經，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效，用于治療肺燥干咳、陰虛癆嗽、喉痹咽痛、津傷口渴、內熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘等癥[1]。主要含有多糖、甾體皂苷、高異黃酮等化學成分，具有抗心肌缺血、降血糖、免疫調節(jié)等藥理作用[2-3]。據(jù)文獻報道，麥冬多糖是麥冬治療心肌缺血的主要有效成分之一，本實驗擬采用正交設計試驗考察麥冬多糖的最佳提取工藝，同時建立乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，驗證此工藝條件下提取的麥冬多糖對缺氧/復氧損傷型冠心病的治療作用，為該藥在治療冠心病方面的大規(guī)模工業(yè)化生產提供理論支持。

1 材料

1.1 儀器與設備

U-3010型紫外可見分光光度計(日本日立公司)；ACCULAB ALC-11C.4型電子天平(德國賽多利斯集團)；CO2培養(yǎng)箱(德國NΜAIRE公司)；SΜNRISE酶標儀(瑞士TECAN公司)。

1.2 藥材與試劑

麥冬藥材(購自安國藥材批發(fā)市場，經遼寧中醫(yī)藥大學藥學院翟延君教授鑒定為百合科植物麥冬Ophiopogonjaponicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥塊根)；葡萄糖對照品(批號110833-200904，購自中國藥品生物制品檢定所)；養(yǎng)心氏片(批號120205，青島國風藥業(yè)股份有限公司)；維拉帕米(批號20140201，天津市中央藥業(yè)有限公司)；乙醇、濃硫酸、苯酚(分析純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基與胎牛血清(NBCS)(均購自美國GIBCO公司)。

1.3 細胞株與動物

SD大鼠原代乳鼠心肌細胞，由本實驗室培養(yǎng)；清潔級昆明小鼠，體重18～22g，雌雄各半，購于大連醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：SCXX(遼)2008-0002。

2 方法與結果

2.1 麥冬多糖檢測方法

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱定105℃干燥至恒重的葡萄糖106.02mg，置于100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，再從中吸取10mL置于100mL容量瓶中，加蒸餾水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 標準曲線繪制 精密吸取葡萄糖對照品0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于15 mL具塞試管中，加水至1.0mL。采用苯酚-硫酸顯色法[4-5]，向各管中分別加入現(xiàn)配置的5%苯酚溶液1.0mL后，再迅速貼壁加入濃硫酸5mL，搖勻，室溫靜置30min。空白調零，在波長488nm處比色，測定吸光度值。以葡萄糖對照品濃度(C)為橫坐標，吸光度值(A)為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程及相關系數(shù)為：Y=8.2835X+0.0402，r=0.9994，葡萄糖在21.204μg/mL～84.816μg/mL之間與吸光度A488有良好的線性關系。

2.2 麥冬多糖提取條件考察

經參考相關文獻，確定影響提取效果的主要因素有溶媒量(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)三個因素，對主要影響因素各取3個水平，進行L9(34)正交試驗，以麥冬多糖含量為考察指標，優(yōu)選最佳提取條件[6-7]。將麥冬藥材粉碎過10目篩，準確稱取麥冬粉末500g，加入8倍量95%乙醇回流脫脂2次，1.5h/次。將藥渣揮干直至無醇味，稱重，將其平均分成10份，隨機選取9份按正交表進行試驗。見表1、表2。

表1 正交試驗考察結果

表2 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19.0。

通過直觀分析和方差分析實驗結果，發(fā)現(xiàn)影響因素的順序為A>B>C，其中對提取率影響最大的為溶媒量(A)，具有顯著性意義(P<0.05)。提取次數(shù)(B)和提取時間(C)的影響差異不大。因此優(yōu)選的麥冬多糖提取條件為A3B1C3，即14倍量的水回流提取3次，每次1 h。由于提取溶媒量具有顯著性差異，且最大量為最佳選擇，故進一步考察了14、18、22倍量溶劑提取多糖的含量，結果差別不大，故確定最佳條件為14倍量的水回流提取3次，每次1h。

2.3 麥冬多糖醇沉濃度考察

取麥冬樣品4份，每份50g，分別用8倍量95%乙醇回流脫脂2次，1.5h/次，藥渣揮干至無醇味，分別加入14倍量的水，在100℃水浴中提取3次，1h/次，抽濾，濃縮。濃縮液分別加入乙醇調至終濃度為70%、75%、80%、85%乙醇，低溫靜置醇沉24h，測定含量，可知乙醇體積分數(shù)達到80%時麥冬多糖的含量最高，結果見圖1。

2.4 麥冬多糖對SD乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用

2.4.1 麥冬多糖含藥血漿的制備 將60只清潔級昆明小鼠隨機分為6組，每組10只。分別為空白組(給予等體積水溶液)、西藥陽性對照組(0.00280g/kg/d)、中藥陽性對照組(0.01404g/kg/d)、麥冬多糖高劑量組(0.04680g/kg/d)、麥冬多糖中劑量組(0.01560g/kg/d)、麥冬多糖低劑量組(0.00520g/kg/d)。每日灌胃給藥2次，0.5mL/次，連續(xù)灌胃3天。取血前12h小鼠禁食不禁水，于最后一次灌胃1h后，摘眼球取血，置含有30μL肝素的2mL離心管中，靜置30min，于高速離心機中，3 000r/min，離心15min，分離血漿，合并同組血漿。經56℃、30 min滅活處理后，過0.22μm微孔濾膜除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 醇沉濃度考察結果

2.4.2 15%含藥血漿對SD乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用 采用400μm的Na2S2O4作用于心肌細胞1h，建立心肌細胞缺氧/復氧損傷模型[8-10]。取中藥陽性對照、西藥陽性對照、麥冬多糖高中低劑量組的含藥血漿，以15%的濃度作用于乳鼠心肌細胞，MTT法考察作用12、24、48h后，心肌細胞的損傷抑制率與時間劑量關系，見表3、圖2。

表3 15%含藥血漿對SD乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的損傷抑制率與時間劑量關系

注：與對照組比較*P<0.05。

結果可知，麥冬多糖高、中、低劑量組與對照組比較均有顯著性差異，其中高劑量作用24h效果最好，損傷抑制率達68.73%，但隨著作用時間的延長，效果減弱；低劑量給藥12、24、48h作用效果穩(wěn)定，且均接近50%；而中劑量損傷抑制率效果較差，均低于10%。

圖2 15%含藥血漿對SD乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的作用

3 討論

本實驗首先采用正交實驗設計方法，優(yōu)選了麥冬多糖最佳提取工藝，得到麥冬多糖提取物，進而采用血漿藥理學方法證實了麥冬多糖灌胃后的小鼠血漿，對SD乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷有明顯的損傷抑制作用，為其藥效物質基礎的闡釋與工業(yè)化生產奠定良好基礎。

麥冬多糖對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用實驗，從給藥劑量角度，麥冬多糖低、高劑量組作用效果更為顯著，優(yōu)于中藥陽性對照藥，而中劑量組損傷抑制作用不夠明顯，呈現(xiàn)出劑量上的非線性關系。從作用時間角度，低劑量作用12、24、48h，損傷抑制率均接近50%，作用效果較為穩(wěn)定；中劑量損傷抑制率均較低，也基本穩(wěn)定；但高劑量作用24h損傷抑制率達到最高點68.73%，明顯高于12、48h，說明麥冬多糖對心肌細胞的保護作用受給藥劑量、給藥時間的影響較大，這可能與藥物在體內的代謝有關，有必要從代謝規(guī)律角度進行更為深入的研究。

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(責任編輯：余 婷)

Study on the Extraction Process of Ophiopogon Polysaccharide Based on Myocardial Cell Hypoxia/Reoxygenation Injury

Wang Shuai1,2,3，Bao Yongrui1,2,3，Yang Xinxin1,2,3，Wang Sisi1，Meng Xiansheng1,2,3*

(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600,China;2. Liaoning province multi-component Chinese Medicine Engineering Technology Research Center，Dalian 116600,China;3. Liaoning Province Modern Traditional Chinese Medicine Research and Engineering Laboratory，Dalian 116600,China;)

Objective:To determine the optimal extraction process of Ophiopogon polysaccharide, and verify the protective effect to myocardial cell hypoxia/reoxygenation injury.Methods:L9(34) orthogonal experiment was used, taking the content of Ophiopogon polysaccharide as index, solvent amount, extraction time, extraction times as examine factors, to screen the optimal extraction process. Single factor experiment was used to examine the best alcohol concentration. On this basis, cells in vitro experiment is adopted to establish the model of rat myocardial cell hypoxia/reoxygenation injury, and the cell damage inhibition rate was taking as index to verify the protective effect of Ophiopogon polysaccharide.Results:The optimal extraction process is 14 times the amount of water, extracting three times, each time 1 h, ethanol precipitation concentration is 80%, with this process, the extract of radix ophiopogonis polysaccharide presents good protective effect to cells of rats myocardial hypoxia/reoxygenation injury, but show a certain dosage, time and efficacy of the nonlinear relationship.Conclusion:This experiment optimized the extraction process of Ophiopogon polysaccharide, and verified the therapeutical effect of polysaccharide on hypoxia/reoxygenation injury model of coronary heart disease, which provide a reference for revealing its efficacy material base and mass industrial production.

Radix Ophiopogonis；Polysaccharides；Extraction Process；Hypoxia/reoxygenation Damage

2014-10-12

“十一五”“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2010ZX09401-304-515)；沈陽市科技計劃項目(F12-146-9-00)

王帥(1984-)，女，碩士，遼寧中醫(yī)藥大學藥學院實驗師，研究方向為中藥質量分析及作用機制研究。

孟憲生(1964-)，男，博士，遼寧中醫(yī)藥大學教授，研究方向為藥物組分配伍、代謝組學及藥品質量分析。E-mail：mxsvvv@126.com

R284.2

A

1673-2197(2015)03-0016-03

10.11954/ytctyy.201503007