張 鶴,馬 寧

(1.遼陽市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 遼陽 111000；2.撫順市中醫(yī)院，遼寧 撫順 113008)

?

HPLC法測定乳癖消結(jié)丸中丹參酮ⅡA、橙皮苷含量

張 鶴1,馬 寧2

(1.遼陽市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 遼陽 111000；2.撫順市中醫(yī)院，遼寧 撫順 113008)

目的：建立乳癖消結(jié)丸中丹參酮ⅡA、橙皮苷高效液相含量測定方法。方法：色譜柱為Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)，丹參酮ⅡA流動(dòng)相：甲醇-水(75∶25)，檢測波長：270nm，流速：1mL/min，柱溫：30℃；橙皮苷流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)，檢測波長：284nm，流速：1mL/min，柱溫：25℃。結(jié)果：丹參酮ⅡA進(jìn)樣量在0.040 3～0.403 2μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=3E+06X-38 932(r=0.999 7)，平均回收率為96.4%，RSD為1.6%(n=6)；橙皮苷進(jìn)樣量在0.115 7～0.694 2μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=787 926X-3 384.3(r=0.999 9)，平均回收率為96.9%，RSD為0.9%(n=6)。結(jié)論：該方法可用于測定乳癖消結(jié)丸中丹參酮ⅡA及橙皮苷的含量，簡便穩(wěn)定、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可作為有效控制該藥物質(zhì)量的參考指標(biāo)。

乳癖消結(jié)丸；丹參酮ⅡA；橙皮苷；HPLC

乳癖消結(jié)丸為撫順市中醫(yī)院制劑，已用于臨床多年，療效確切，具有軟堅(jiān)散結(jié)、行氣止痛的功效，主要用于治療肝郁痰凝所致的乳腺內(nèi)腫塊、乳增生、乳癖、乳癌等癥。該藥物由丹參、青皮、牡蠣、鱉甲、穿山甲、川楝子、紅花、青皮、延胡索、通草等十二味中藥粉碎加煉蜜制成。目前，乳癖消結(jié)丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有對(duì)丹參酮ⅡA及橙皮苷的TLC定性鑒別，且無含量測定標(biāo)準(zhǔn)，因此不能準(zhǔn)確有效控制藥品的質(zhì)量。方中丹參活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛，青皮對(duì)于消除乳腫、乳核具有獨(dú)特功效。本文對(duì)方中主藥丹參及青皮中有效成分丹參酮ⅡA及橙皮苷有效成分進(jìn)行含量測定[1-7]，探討更加準(zhǔn)確、有效的藥品質(zhì)量控制方法，以保證藥品質(zhì)量穩(wěn)定性，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀LC-2010(日本島津公司)，LC-10AT vp輸液泵；HS-3120型超聲波清洗器，賽多利斯電子天平BP211-D。

1.2 試劑與試藥

乳癖消結(jié)丸(遼陽市中醫(yī)院制劑室，批號(hào)：20140306、20140521、20140615)；丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào)：110766-200619，中國食品藥品檢定研究院)，橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：110721-201316，含量95.3%，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇、乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為DiamonsilC18(200mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(75∶25)；檢測波長：270nm；流速：1mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.1.2 溶液配制 ①對(duì)照品溶液制備。精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，加甲醇制成0.2mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2mL加甲醇定容至25mL容量瓶，制得16μg/mL的對(duì)照品溶液。

②供試品溶液制備。取本品適量，研細(xì)，精密稱取1.0g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱重，冷浸2h，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

③陰性對(duì)照溶液制備。取除丹參外的其他各味藥材，按處方比例，粉碎，加煉蜜制成陰性對(duì)照樣品，再按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性空白溶液各10μL，注入高效液相色譜儀測定。在上述色譜條件下，丹參酮ⅡA峰與其它色譜峰達(dá)到基線分離，陰性空白溶液無干擾。見圖1。

2.1.4 線性范圍考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、2、3、4、5mL置于25mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別制成4、8、16、24、32、40μg/mL的對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣10μL。按上述色譜條件測定，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明進(jìn)樣量在0.040 3～0.403 2μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=3E+06X-38 932，r=0.999 7。

2.1.5 精密度試驗(yàn)考察 精密吸取對(duì)照品溶液10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定樣品中丹參酮ⅡA色譜峰面積。測定結(jié)果RSD為0.92%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)考察 精密吸取同一份供試品溶液，分別于配置后0、2、4、8、16、24h進(jìn)樣10μL，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件，測定樣品中丹參酮ⅡA色譜峰面積。結(jié)果顯示，RSD為0.87%，表明供試品溶液制備24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)考察 取同一批次乳癖消結(jié)丸樣品(批號(hào)：20140306)6份，按供試品溶液制備方法提取、制備，測定丹參酮ⅡA平均含量為0.42mg/g，RSD為1.0%。測定結(jié)果提示，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)考察 取已知含量同一批號(hào)樣品(批號(hào)：20140306)6份，每份約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，再分別精密加入0.224 0mg/mL(精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品11.20mg，加甲醇定容至50mL容量瓶)的丹參酮ⅡA對(duì)照品1mL，按“2.1.2”項(xiàng)方法配制供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測定丹參酮ⅡA含量，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，平均回收率為96.4%，RSD為1.6%(n=6)。見表1。

圖1 丹參酮ⅡA HPLC色譜

2.1.9 樣品測定 取3個(gè)不同批次樣品，按供試品制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，測定色譜峰面積。結(jié)果見表2。

2.2 橙皮苷含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)；檢測波長：284nm；流速：1mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL；理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2 溶液的配制 ①對(duì)照品溶液制備。精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.2mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2mL加甲醇定容至25mL容量瓶中，制得40μg/mL對(duì)照品溶液。

②供試品溶液制備。取本品適量，研細(xì)，精密稱取0.2g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱重，冷浸2h，超聲處理1h，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

表1 丹參酮ⅡA加樣回收率試驗(yàn)測定結(jié)果 (n=6)

表2 丹參酮ⅡA含量測定結(jié)果 (n=3，mg·g-1)

③陰性對(duì)照溶液制備。取除青皮外其他各味藥材，按處方比例，粉碎加煉蜜制成陰性對(duì)照樣品，按上述供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性空白溶液各10μL，注入高效液相色譜儀測定。在上述色譜條件下，橙皮苷峰與其他色譜峰達(dá)到基線分離，陰性空白溶液無干擾。見圖2。

圖2 橙皮苷 HPLC色譜

2.2.4 線性范圍考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、1.5、2、2.5、3mL置于10mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別制成10、20、30、40、50、60μg/mL的對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣10μL，按上述色譜條件測定，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明進(jìn)樣量在0.115 7～0.694 2μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=787 926X-3 384.3，r=0.999 9 。

2.2.5 精密度試驗(yàn)考察 精密吸取對(duì)照品溶液10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定樣品中橙皮苷色譜峰面積。測定結(jié)果RSD為0.96%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)考察 精密吸取同一份供試品溶液，分別于配置后0、2、4、8、16、24h進(jìn)樣10μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件，測定樣品中橙皮苷色譜峰面積。測定結(jié)果RSD為0.92%，表明供試品溶液制備24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)考察 取同一批次乳癖消結(jié)丸樣品6份，按供試品溶液制備方法提取、制備、測定，橙皮苷平均含量為1.21mg/g ，RSD為1.10%。測定結(jié)果提示，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)考察 取已知含量的同一批號(hào)樣品(批號(hào)：20140306)6份，每份約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入0.604 2 mg/mL(精密稱取橙皮苷對(duì)照品15.85mg，加甲醇定容至25mL)的橙皮苷對(duì)照品1mL，按“2.2.2”項(xiàng)方法配制供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測定橙皮苷含量，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，平均回收率為96.9%，RSD為0.9%(n=6)。見表3。

2.2.9 樣品測定 取3個(gè)不同批次樣品，按供試品制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，測定色譜峰面積。結(jié)果見表4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)丹參酮ⅡA、橙皮苷成份冷浸后超聲提取及直接超聲提取方法進(jìn)行考察，研究發(fā)現(xiàn)冷浸后超聲提取含量較直接超聲提取含量高，因此采用冷浸后超聲提取。關(guān)于橙皮苷流動(dòng)相的選擇，比較不同比例的甲醇-磷酸和乙腈-磷酸溶液，研究發(fā)現(xiàn)甲醇-磷酸鹽溶液會(huì)產(chǎn)生基線不穩(wěn)，最終確定乙腈-磷酸溶液(21∶79)系統(tǒng)為流動(dòng)相，該系統(tǒng)分離度和峰型均良好。

乳癖消結(jié)丸作為撫順市中醫(yī)院臨床常用藥，方中有效成分的含量可正面反映該制劑質(zhì)量的優(yōu)劣，因此應(yīng)進(jìn)行組方中藥品成分含量的檢測，更好地控制藥物臨床療效及藥品質(zhì)量。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[2] 劉靜，戴忠，王鋼力，等.丹參活性成分及相關(guān)分離分析方法研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(11)：288-295

[3] 于百青，楊 敏，孫鵬云．高效液相色譜法測定心舒丸中丹參酮ⅡA含量[J]．中國藥業(yè)，2012，21(13)：36-37．

[4] 吳德明，董茂臣，唐文君．高效液相色譜法測定乙肝扶正膠囊中丹參酮ⅡA的含量[J]．黑龍江中醫(yī)藥，2012(2)：49-50．

[5] 張瑞．HPLC法測定橘紅片中橙皮苷和柚皮苷的含量[J]．安徽醫(yī)藥，2013，17(3)：401-402．

[6] 張維，張志云，禮彤，等．HPLC法同時(shí)測定冠脈康片中橙皮苷和芍藥苷的含量 [J]．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15(8)：53-55．

[7] 劉玉春，張 靜．HPLC同時(shí)測定橘紅枇杷膠囊中橙皮苷、柚皮苷的含量[J]．安徽醫(yī)藥，2013，17(12)：2044-2045.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

Content Determination of TanshinoneⅡA and Hesperidin in Rupixiao Node Pills by HPLC method.

ZhanG He1, Ma Ning2

(1.Liaoyang Institute for Food and Drug Control, Liaoyang 111000,China;2.Fushun Hospital of Traditional Chinese Medicine,Fushun 113008,China)

Objective:To establish the content determination of tanshinoneⅡA and hesperidin in Rupixiao node pills by HPLC. Methods:The column was Diamonsil C18(200mm×4.6mm,μm), Tanshinone II A mobile phase was methanol-water (75∶25),detection wavelength was 270nm, flow rate was 1mL/min .The column temperature: 30 ℃. Hesperidin the mobile phase was 0.2% phosphoric acid solution (21∶79), detection wavelength was 284nm, flow rate was 1mL/min. The column temperature: 25℃.Results:Tanshinone IIA in 0.040 3μg～0.403 2μg showed a good linear relationship with the peak area range, The regression equation was: Y=3E+06X-38932(r=0.9997).The average recovery was 96.4%, with RSD of 1.6%(n=6). Hesperidin in 0.115 7～0.694 2μg showed a good linear relationship with the peak area range, The regression equation was: Y=787 926X -3 384.3(r=0.999 9).The average recovery was 96.9%, with RSD of 0.9%(n=6).Conclusion:The method was used to determine the content of nodes in Rupixiao pills of tanshinone A and hesperidin simple and stable, high sensitivity, good reproducibility, Can be used as reference for the effective control of the drug quality.

Rupixiao Node Pills; TanshinoneⅡA; Hesperidin; HPLC

2015-01-27

張鶴(1982-)，女，遼寧省遼陽市食品藥品檢驗(yàn)所主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴帣z驗(yàn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：95137509@qq.com

R286.0

A

1673-2197(2015)12-0024-03

10.11954/ytctyy.201512010