周澤琴，張雄飛，胡梁及，蔡 興，鐘娜娜，朱盛山

(廣東藥學(xué)院 中藥開(kāi)發(fā)研究所，廣東 廣州 510006)

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抗瘧中草藥篩選及其有效部位研究

周澤琴，張雄飛，胡梁及，蔡 興，鐘娜娜，朱盛山*

(廣東藥學(xué)院 中藥開(kāi)發(fā)研究所，廣東 廣州 510006)

目的：為尋找新的有效抗瘧藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：建立伯氏瘧原蟲(chóng)鼠瘧實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，比較常山復(fù)方、金牛草、山豆根、鵝不食草、常山、仙鶴草、青蒿等藥物的50%醇提取物抗瘧活性，比較抗瘧活性最強(qiáng)醇提取物中不同萃取部位對(duì)瘧原蟲(chóng)的抑制效果。結(jié)果：常山復(fù)方的50%醇提取物瘧原蟲(chóng)抑制率為83.46%，高于青蒿藥材的67.33%，抗瘧效果比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；常山復(fù)方的50%醇提取物乙酸乙酯萃取部位對(duì)瘧原蟲(chóng)的抑制率達(dá)93.78%，與青蒿素的95.92%接近。結(jié)論：常山復(fù)方乙酸乙酯萃取物具有顯著的抗瘧活性，可作為抗擊瘧疾的候選藥物。

抗瘧；常山復(fù)方；伯氏瘧原蟲(chóng)；抑制率

自上世紀(jì)50年代開(kāi)始，常山具有抗瘧效果已有報(bào)道[1-2]。解放初期，由于奎寧系列抗瘧藥物供不應(yīng)求、價(jià)格昂貴等原因，常山作為抗瘧代用藥物開(kāi)始在臨床使用，并取得了良好效果。例如，湖北省麻城縣的352 100例瘧疾患者服用常山藥物，治療后普查復(fù)發(fā)率僅為0.004 8%[3]。中醫(yī)認(rèn)為，瘧疾乃肝脾同病，需肝脾同治[4-5]。本文選用常山復(fù)方，以常山截瘧為主，輔以柴胡等中草藥疏肝散瘀，養(yǎng)風(fēng)木、培中土，共復(fù)健運(yùn)之本。大量研究報(bào)道[6-7]表明，仙鶴草主要抗瘧活性物質(zhì)為脂溶性酚類成分。湖南省寧鄉(xiāng)縣衛(wèi)生院以金牛草煎劑對(duì)抗瘧疾，效果顯著[8]。許昌地區(qū)五十一種中草藥抗鼠瘧實(shí)驗(yàn)報(bào)告顯示，山豆根、鵝不食草等中草藥醇提物具有顯著的抗瘧活性[9]。本研究以伯氏瘧原蟲(chóng)感染小鼠為動(dòng)物模型，針對(duì)各地報(bào)道的抗瘧單方、驗(yàn)方和民間草藥進(jìn)行抗瘧活性評(píng)價(jià)，為尋找新的抗瘧藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠(許可證號(hào)：syxk-粵2013-0020)，標(biāo)準(zhǔn)體重(20±2)g，共86只，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 鼠瘧原蟲(chóng)

伯氏瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株K173(Plasmodium berghei k173,P.b.k173)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技園提供。

1.3 試劑及儀器

青蒿素Artemisinin,ART(廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：100651，含量：100.3%)；蒸餾水、吉氏染液、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、乙醇等均為分析純。

光學(xué)顯微鏡(B205，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)、電子天平(BT211B，德國(guó)Sartorius公司)、載玻片、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、手掀計(jì)數(shù)器、注射器、載玻片、剪刀、鑷子等。

1.4 樣品制備

1.4.1 青蒿素溶液制備 精密稱取青嵩素15.5mg,置于研缽內(nèi)研磨成細(xì)粉末狀,加入0.5%的羧甲基纖維素鈉生理鹽水5mL,繼續(xù)研磨,制成濃度為1.24mg/0.4mL的藥液，置4℃冰箱冷藏備用。

1.4.2 中草藥提取物 分別取常山復(fù)方、金牛草、山豆根、鵝不食草、常山、仙鶴草、青蒿各500g，粉碎，過(guò)篩，以10倍量50%的乙醇提取2次,每次1h，減壓回收乙醇，濃縮至稠膏，得粗提物；將常山復(fù)方粗提物與蒸餾水混懸，依次用乙酸乙酯、石油醚、氯仿、正丁醇萃取至有機(jī)層無(wú)色，回收有機(jī)溶劑，冷凍干燥，得到常山復(fù)方的乙酸乙酯提取物、石油醚提取物、三氯甲烷提取物、正丁醇提取物，各提取部位密封置4℃冰箱冷藏備用，臨用前用0.5%的羧甲基纖維素鈉稀釋至所需濃度。

1.5 伯氏瘧原蟲(chóng)鼠瘧模型建立

取伯氏瘧原蟲(chóng)常規(guī)株，復(fù)蘇后接種3只健康小鼠,每只腹腔注射0.2mL感染血液,作為血傳第一代；接種后5天，血傳3只健康小鼠，作為血傳第二代；接種后5天,將待試驗(yàn)小鼠稱重隨機(jī)分組，雌雄各半，并分別血傳接種試驗(yàn)小鼠,即為伯氏瘧原蟲(chóng)常規(guī)鼠瘧模型[10]。

1.6 分組及給藥方法

將78只已感染瘧原蟲(chóng)小鼠隨機(jī)分為13組，每組6只，分別為模型組、青蒿素對(duì)照組、常山醇提物用藥組、金牛草醇提物用藥組、鵝不食草醇提物用藥組、山豆根醇提物用藥組、仙鶴草醇提物用藥組、青蒿醇提物用藥組、常山復(fù)方醇提物用藥組、常山復(fù)方三氯甲烷萃取物用藥組、常山復(fù)方正丁醇萃取物用藥組、常山復(fù)方乙酸乙酯萃取物用藥組、常山復(fù)方石油醚萃取物用藥組。用藥組小鼠給予相應(yīng)中藥材醇提物飼養(yǎng)，模型組給予等體積生理鹽水。3～4h后按1.365g/kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃給首劑藥，連續(xù)給藥4天。

1.7 制片與鏡檢

于小鼠尾部取約1μL的血量，制血膜，編號(hào)。甲醇固定，待干后用吉氏染液染色25min，清水細(xì)流沖洗干凈、晾干。鏡檢50個(gè)油鏡視野(相當(dāng)于2×104紅細(xì)胞(RBC))未見(jiàn)原蟲(chóng)者為陰性；原蟲(chóng)感染率<1%，計(jì)算104個(gè)RBC；感染率1%～10%，計(jì)算103個(gè)RBC；感染率10%以上，計(jì)算500個(gè)RBC。通過(guò)油鏡計(jì)算紅細(xì)胞感染瘧原蟲(chóng)的百分?jǐn)?shù)、感染率及抑制率，計(jì)算公式如下：

感染率=(感染紅細(xì)胞數(shù)/紅細(xì)胞總數(shù))×100%

抑制率=(模型組RBC感染率-用藥組平均RBC感染率)/模型組RBC感染率×100%

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同中草藥醇提物抗瘧效果比較

在選取的7種藥物中，以常山復(fù)方醇提物用藥組抗瘧效果最佳，對(duì)感染伯氏瘧原蟲(chóng)小鼠的紅細(xì)胞抑制率可達(dá)83.46%，青蒿、常山及仙鶴草用藥組分別為67.33%、65.76%、65.03%，山豆根、金牛草、鵝不食用藥組抗瘧效果相當(dāng)，為55%～60%。與模型組比較，7種藥材用藥組均有顯著的抗瘧活性(P<0.05)；常山復(fù)方抗瘧效果優(yōu)于青蒿用藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；常山用藥組與青蒿用藥組抗瘧效果無(wú)顯著性差異(P>0.05)；金牛草、鵝不食草、山豆根、仙鶴草等用藥組抗瘧效果均低于青蒿用藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同中草藥醇提物抗瘧效果比較 ±s，n=6)

注：與模型組比較，*P<0.05；與青蒿醇提物對(duì)照組比較，▲P<0.05。

2.2 常山復(fù)方提取物不同提取部位抗瘧效果比較

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取抗瘧效果最佳的常山復(fù)方進(jìn)一步篩選抗瘧有效部位。與模型組比較，常山復(fù)方的乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、三氯甲烷提取物、石油醚提取物用藥組均有顯著的抗瘧活性(P<0.05)。其中，乙酸乙酯提取物對(duì)感染伯氏瘧原蟲(chóng)小鼠紅細(xì)胞抑制率達(dá)93.78%，僅略低于青蒿素對(duì)照組的95.92%，明顯優(yōu)于正丁醇提取物、三氯甲烷提取物、石油醚提取物用藥組，其他三組提取物抑制率分別為70.99%、62.30%、18.95%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 常山復(fù)方提取物不同提取部位抗瘧效果比較 ±s，n=6)

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.3 不同藥物對(duì)小鼠感染瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞的影響

被瘧原蟲(chóng)寄生的紅細(xì)胞出現(xiàn)脹大，甚至形變，胞質(zhì)致密，色深藍(lán)，幾乎充滿被寄生的紅細(xì)胞內(nèi)，棕褐色瘧色素散在。在光學(xué)顯微鏡油鏡視野下，被瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞數(shù)量從小到大依次為青蒿素對(duì)照組、常山復(fù)方乙酸乙酯萃取物用藥組、常山復(fù)方醇提物用藥組、常山醇提物用藥組、模型對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

圖1 不同藥物對(duì)小鼠感染瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞的影響

3 討論

目前，我國(guó)青蒿產(chǎn)量少,且青蒿素含量低,青蒿素類藥物的商品價(jià)格較高。在瘧疾高發(fā)的非洲地區(qū)，大部分國(guó)家經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療衛(wèi)生水平普遍較低,多數(shù)瘧疾患者可應(yīng)用青蒿素類藥物的概率依然較小,全球抗瘧形勢(shì)仍不容樂(lè)觀[11]。在選取的7種抗瘧藥物中，以常山復(fù)方抗瘧效果最佳，青蒿、常山次之，金牛草、鵝不食草、山豆根、仙鶴草效果較差。其中，常山復(fù)方的乙酸乙酯提取部位抗瘧效果最優(yōu)。據(jù)記載，常山有截瘧劫痰之效，可用于解熱、抗阿米巴、除痰、瘧疾等[3，12]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)常山抗瘧效果明顯，但以常山為主的復(fù)方抗瘧效果更佳，優(yōu)于青蒿藥材；且常山復(fù)方的乙酸乙酯萃取部位抗瘧效果與青蒿素相當(dāng)。在青蒿素耐藥性日益顯現(xiàn)、價(jià)格高居不下的情況下，尋找常山復(fù)方藥材提取物的抗瘧活性成分，闡明其作用機(jī)制，應(yīng)用前景較大。

[1] 趙承嘏,謝毓元.常山葉中之抗瘧質(zhì)素[J].中國(guó)科學(xué),1951(4):455-457.

[2] 村田清志.常山的抗瘧作用[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)·中醫(yī)中藥分冊(cè),1998,20(5):61-62.

[3] 中共湖北省委除害滅病辦公室.使用中藥常山抗瘧的經(jīng)驗(yàn)[J]. 中醫(yī)雜志,1959,1(4):35-37.

[4] 柳寶怡．柳寶怡醫(yī)案[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1981:57.

[5] 柳寶怡．增評(píng)柳選四家醫(yī)案[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1983:272.

[6] 洪閣,戴永紅,劉培勛,等.仙鶴草化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)服務(wù)與研究,2008,8(5):362-366.

[7] 黃蘭孫.廿年來(lái)抗瘧藥物化學(xué)研究進(jìn)展(續(xù))[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1983,20(8):633-639.

[8] 宋大仁.介紹幾種防治瘧疾的速效療法[J].江西中醫(yī)藥,1959,8(8):17-19.

[9] 王順祥,陳松枝,韓勇,等.許昌地區(qū)五十一種中草藥抗鼠瘧實(shí)驗(yàn)初步報(bào)告[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,1980,8(4):12-19.

[10] 孫雪英. 復(fù)方蒿甲醚對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)青蒿素抗性鼠瘧療效與其它抗瘧藥療效比較的研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[11] 王順祥,李書(shū)迠. 抗瘧中草藥青蒿的研究[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,1978,6(2):20-29.

[12] 趙燦熙. 常山提取物對(duì)氯喹敏感株和抗氯喹株鼠瘧原蟲(chóng)的效應(yīng)觀察[J]. 同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1986(2):129-132.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

Screen The Antimalarial Chinese Medicinal Herb and Research its Effective Parts

Zhou Zeqin，Zhang Xiongfei，Hu Liangji，Cai Xing，Zhong Nana，Zhu Shengshan*

(Research and Development Institute of Chinese Materia Medica, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

Objective:For finding new, effective antimalarial medicines and provide experimental bases.Methods:The experimental models were established by mice infected with Plasmodium berghei. Compare the antimalarial activity of 50% ethanol extracts of compound Dichroa febrifuga Lour，Polygala arvensis Willd，Radix Sophorae Subprostratae，Centipeda minima，Dichroa febrifuga Lour，Agrimonia pilosa，Artemisia apiacea. Picked out the highest reactive ethanol extracts :compound Dichroa febrifuga Lour. Then, compare the suppression effect on plasmodium from its different extractive fractions.Results:The plasmodium inhibition of 50% ethanol extracts of compound Dichroa febrifuga Lour and Artemisia apiacea were 83.46% and 67.33%, respectively , which had statistical significance (P< 0.05); The plasmodium inhibition of ethyl acetate extracts of compound Dichroa febrifuga Lour was 93.78% and artemisinin was 95.92%.Conclusion:The ethyl acetate extracts of compound Dichroa febrifuga Lour has significant antimalarial activity,which could be the new candidate antimalarial medicines as a priority.

Antimalarial;Compound Dichroa Febrifuga Lour; Plasmodiumberghei;Inhibition

2015-05-05

周澤琴(1990-)，女 ，廣東藥學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)中藥現(xiàn)代化。E-mail: m18826413913@163.com

朱盛山(1957-)，男，廣東藥學(xué)院教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)中藥現(xiàn)代化。E-mail: zhush3@126.com

R289

A

1673-2197(2015)16-0006-03

10.11954/ytctyy.201516004