朱李雯

(溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟學(xué)院，浙江 溫州 325035)

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構(gòu)建及鑒定堿性成纖維細胞生長因子重組真核載體pCMV-sbFGF

朱李雯

(溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟學(xué)院，浙江 溫州 325035)

目的：構(gòu)建可分泌表達bFGF蛋白的重組真核表達載體，并檢測哺乳動物細胞的表達情況，為缺血性腦卒中基因治療提供新的途徑。方法：運用PCR技術(shù)將bFGF基因進行擴增，通過重疊PCR技術(shù)將FGF-21的信號肽序列(FGF-21-SP)和bFGF基因連接，使用限制性內(nèi)切酶和T4連接酶將重疊PCR產(chǎn)物FGF-21-SP-bFGF基因?qū)氲絧shuttle質(zhì)粒載體中，再通過轉(zhuǎn)染將重組真核載體轉(zhuǎn)入293T細胞中，通過Western blot技術(shù)檢測bFGF的表達。結(jié)果：成功構(gòu)建帶有分泌型bFGF基因的pshuttle質(zhì)粒載體，Western blot檢測顯示在真核細胞293T中成功表達。結(jié)論：成功構(gòu)建可分泌表達bFGF蛋白的重組真核表達載體，在真核細胞中高效表達，為開發(fā)可分泌表達bFGF蛋白的重組基因治療載體奠定實驗基礎(chǔ)。

FGF-21信號肽；分泌型表達bFGF；pshuttle質(zhì)粒載體；真核表達

腦血管病是目前被公認為危害人類健康和生命安全最嚴重的疾病之一[1]。全國第三次死因調(diào)查結(jié)果顯示，在我國腦血管病患者死因多為惡性腫瘤和心臟病，占死亡總數(shù)的22.45%，成為我國城鄉(xiāng)居民死亡的主要疾病。

堿性成纖維細胞生長因子[2](bFGF)是由155個氨基酸所組成的18kD多肽，主要分布在垂體、腦和神經(jīng)組織及視網(wǎng)膜、腎上腺、胎盤等組織。因此，bFGF可促進來源于中胚層和神經(jīng)外胚層多類型細胞增殖及分化，具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)。bFGF主要由星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，通常成年哺乳動物腦組織呈較低水平表達，但腦組織受到損傷后bFGF表達顯著上調(diào)。bFGF能促進血管生成、組織修復(fù)、神經(jīng)保護、軸突再生、動員內(nèi)源性神經(jīng)干細胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與損傷修復(fù)過程中起著重要作用。bFGF除直接給藥外，還可通過轉(zhuǎn)基因方式將bFGF基因?qū)氚屑毎?，再將帶有轉(zhuǎn)基因的靶細胞植入病變器官進行表達，達到治療效果[3]。但由于bFGF缺乏信號肽序列，限制其分泌表達能力處于較低水平，并限制其他方面的應(yīng)用[4]。

本實驗，采用PCR技術(shù)將bFGF基因進行擴增，通過重疊PCR 技術(shù)將FGF-21的信號肽序列(FGF-21-SP)與bFGF基因進行連接，使用限制性內(nèi)切酶和T4連接酶將重疊PCR產(chǎn)物FGF-21-SP-bFGF基因?qū)氲絧shuttle質(zhì)粒載體中，再通過轉(zhuǎn)染將重組真核載體轉(zhuǎn)入293T細胞中，通過Western blot技術(shù)檢測其bFGF的表達。檢測結(jié)果顯示，實驗成功構(gòu)建帶有分泌型bFGF基因的pshuttle重組質(zhì)粒載體，Western blot檢測顯示其在真核細胞293T中成功高效表達，為后續(xù)開發(fā)可分泌表達bFGF蛋白的重組基因治療載體用于缺血性腦卒中奠定實驗基礎(chǔ)。現(xiàn)將實驗報道如下。

1 材料

1.1 實驗儀器

微量離心機，全能臺式高速冷凍離心機，高速冷凍離心機，大容量恒溫振蕩器，PCR擴增儀，隔水式恒溫培養(yǎng)箱，細菌培養(yǎng)箱，立式壓力蒸汽滅菌器，小型水平，垂直電泳槽。

1.2 菌株與質(zhì)粒

菌株為大腸桿菌DH5a，質(zhì)粒pENTR-D-TOPO-bFGF-IRES-hrGFP、pshuttle-IRES-hrGFP-1，引物 S-bFGF R、 S-bFGF F、 FGF21-SP R、FGF21-SP F。

2 方法

2.1 載體構(gòu)建及測序

2.1.1 pshuttle-FGF21-SP-bFGF-hrGFP質(zhì)粒構(gòu)建 在超凈臺進行操作，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α擴增并提取pshuttle-IRES-hrGFP-1質(zhì)粒。以質(zhì)粒pENTR-D-TOPO-bFGF-IRES-hrGFP為模板，擴增bFGF基因。

FGF-21信號肽序列的合成及擴增：FGF-21信號肽序列合成(FGF-21-SP)atggactcggacgagaccgggttcgagcactcag gactgtgggtttctgtgctggctggtcttctgctgggagcctgccaggca；FGF-21信號肽序列進行PCR擴增。

FGF-21-SP-bFGF重疊PCR擴增：(1)重疊PCR擴增體系：

98℃ 15s

無引物 95℃ 2min → 50℃ 15s →5cycle

72 ℃ 2min

98℃ 15s

加入引物 95℃ 3min → 60℃ 15s →30cycle →72℃ 20min → 4℃∞

72℃ 150s

(2)FGF-21-SP-bFGF純化；(3) 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

質(zhì)粒pshuttle-IRES-hrGFP-1 和FGF21-SP-bFGF分別進行Bgl II和Xho I雙酶切：pshuttle-IRES-hrGFP-1質(zhì)粒雙酶切1h并純化；凝膠瓊脂糖電泳證實酶切產(chǎn)物，并分別予以濃度定量。

過夜連接質(zhì)粒pshuttle-IRES-hrGFP-1 和FGF21-SP-bFGF。將質(zhì)粒過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α。在FGF21-SP-bFGF的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中隨機挑取4個單菌落，搖菌擴增，提取質(zhì)粒pshuttle-S-bFGF-hrGFP。質(zhì)粒pshuttle-S-bFGF-hrGFP進行Bgl II和Xho I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將重組質(zhì)粒送測序，-80℃保存菌種

2.1.2 質(zhì)粒保存 pshuttle-S-bFGF-hrGFP送測序，-80℃保存菌種。

2.2 表達鑒定

293T細胞經(jīng)培養(yǎng)后進行細胞轉(zhuǎn)染，進行Western blot技術(shù)檢測。

3 結(jié)果

3.1 載體構(gòu)建及測序結(jié)果

3.1.1 pshuttle-S-bFGF-hrGFP質(zhì)粒構(gòu)建 pshuttle-S-bFGF-hrGFP質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果與理論大小相符合。

3.1.2 質(zhì)粒pshuttle-S-bFGF-hrGFP送測序結(jié)果 pshuttle-S-bFGF-hrGFP質(zhì)粒送上海生物工程公司測序，測序結(jié)果與預(yù)期值相符合。

3.2 表達鑒定

3.2.1 293T細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果 帶有分泌型bFGF基因的質(zhì)粒在真核細胞293T中成功轉(zhuǎn)染，與預(yù)期結(jié)果一致。見圖1。

3.2.2 Western blot技術(shù)檢測 結(jié)果顯示帶有分泌型bFGF基因的質(zhì)粒在真核細胞293T中成功表達。見圖2。

4 討論

bFGF反應(yīng)是由細胞膜上受體介導(dǎo)的,目前已知受體有4種,分別為FGR-1、FGR-2、FGR-3和FGR-4,受體在各種組織中分布以及功能均不同。FGF家族中大多數(shù)成員均具備完整的信號肽序列,且能夠通過經(jīng)典內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—高爾基體途徑分泌到細胞外,但其中aFGF與bFGF大量分布在胞漿或核內(nèi)。研究表明,aFGF與bFGF均缺乏信號肽序列,兩者分泌可能存在其他運輸途徑,也可能是細胞損傷后釋放到細胞外[5]。考慮bFGF的生物學(xué)功能是由受體所介導(dǎo)的,嚴重限制bFGF在組織工程、基因治療、細胞治療及其他各方面的應(yīng)用。研究實驗在bFGF基因5c端引入一段信號肽序列,目的基因在胞漿內(nèi)進行合成后,分泌到培養(yǎng)液中,再將引入信號肽切除,操作并不影響bFGF的活性[6]。

293T細胞是由293細胞所派生的，表達SV40大T抗原的人腎上皮細胞系，293T細胞廣泛用于表達各種目標(biāo)蛋白，或包裝病毒[7]。293T是貼壁細胞，對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分要求不高。293T細胞的生長狀態(tài)直接關(guān)系包裝病毒及轉(zhuǎn)染效率，因此應(yīng)盡量選擇傳代次數(shù)少、培養(yǎng)總時間短的細胞。293T細胞應(yīng)用廣泛，但在正常培養(yǎng)條件下，難以將細胞傳代下去，且包裝病毒效率較低，轉(zhuǎn)染效率也較低。因此，實驗必須對細胞培養(yǎng)的設(shè)備環(huán)境進行定期清潔。此外，還要對器材進行徹底消毒，積極做好實驗室各方面工作。

圖1 293T細胞轉(zhuǎn)染后在白光下pshuttle-FGF-21-S-bFGF100倍與pshuttle空質(zhì)粒100倍顯像

圖2 Western blot技術(shù)檢測結(jié)果

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[3] 孫奮勇，陳小佳，洪岸. bFGF在原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞中的高效分泌表達[J].暨南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2004，25(6)：668-674.

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(責(zé)任編輯：李嵐春)

2014-09-21

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃推廣項目(新苗人才計劃)“氧調(diào)控性bFGF基因修飾神經(jīng)干細胞的研制及其潛在臨床應(yīng)用價值研究”(2012R413048)

朱李雯，女，溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟學(xué)院在讀生，研究方向為中藥學(xué)。

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1673-2197(2015)06-0016-02

10.11954/ytctyy.201506007