朱振標(biāo) 沈 慧 林之斌 丁曉莉 劉亦恒

?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心（?？?70208）

骨質(zhì)疏松（OP）是一種常見的老年性疾病，近幾年來隨著我國人口的老齡化，OP的發(fā)病率逐年上升，近年來，科學(xué)家們開始關(guān)注一組在人體內(nèi)具有雌激素樣作用的化合物，這些化合物主要包括金雀異黃素、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、丹參酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮等。這一類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素非常相似，其可發(fā)揮擬雌激素或抗激素效應(yīng)。補(bǔ)骨脂二氫黃酮是補(bǔ)骨脂中的主要有效成分，其具有類似于植物雌激素的作用，而且毒副作用低微，因此可作為雌激素的替代品長期服用，避免了雌激素的致癌作用，值得深入的研究探討。為了研究補(bǔ)骨脂二氫黃酮防治OP的作用機(jī)制，本次實(shí)驗(yàn)觀察了補(bǔ)骨脂二氫黃酮對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的影響，探討補(bǔ)骨脂二氫黃酮防治OP的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用3月齡清潔級(jí)、雌性SD大鼠，共60只，體重為180±20g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司［許可證號(hào)：SCXK（湘）2009－0012］。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 補(bǔ)骨脂二氫黃酮粉（有效成分含量為40%）；免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；γ－氨基丁酸B1型受體（GABABRI）多克隆抗體（英國Abcam公司生產(chǎn)）；γ－氨基丁酸（GABA）多克隆抗體（武漢博士德生物有限公司生產(chǎn)）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物公司生產(chǎn)）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 雙能X線骨密度儀（美國Lunar公司，Prodigy型）；電子天平（ACS－3C型，廣州中山市新和基科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)）；高速冷凍離心機(jī)（2－16K，德國Sigma公司）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO－RAD公司，GELEQ）。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用自來水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組20只、手術(shù)組40只。假手術(shù)組大鼠行腹腔手術(shù)找到卵巢，但不切除，手術(shù)組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。12周后檢測股骨骨密度及尿鈣值，以確定OP動(dòng)物模型是否復(fù)制成功，若成功后即將40只手術(shù)組大鼠再隨機(jī)分為模型組20只、補(bǔ)骨脂二氫黃酮給藥組20只。

2.2 制作OP模型 OP模型制做參照文獻(xiàn)中的方法［1］，切除雙側(cè)卵巢制作大鼠OP模型。

將稱重后的各組大鼠腹腔按40m／kg的劑量注射2%戊巴比妥鈉，行全身麻醉后取仰臥位，固定后腹部剃毛并消毒，沿下腹部正中腹白線作縱行切口（切口長度約2～3cm），打開腹腔后切除大鼠雙側(cè)卵巢，術(shù)后切口用75%酒精棉球消毒。假手術(shù)組亦打開腹腔，但并不切除卵巢。術(shù)后為預(yù)防感染各組大鼠均腹腔注射10萬單位青霉素（3mL／只），1d1次，連續(xù)3d。

2.3 給藥方法 模型復(fù)制成功后，給藥組大鼠用補(bǔ)骨脂二氫黃酮灌胃（50mg／kg·d）。將藥物稀釋成1.0mL／100g體重（5mg／mL）后即進(jìn)行灌胃，灌胃前12h應(yīng)禁食不禁水1d1次，持續(xù)12周。同時(shí)假手術(shù)組和模型組用等量生理鹽水灌胃，同樣持續(xù)12周。

2.4 股骨骨密度及尿鈣測定 分別于手術(shù)后第12周及灌胃后12周，對各組大鼠行全身麻醉后采用雙能X線骨密度儀測定股骨骨密度。收集各組大鼠尿液，測定24h尿鈣排泄量。

2.5 標(biāo)本采集 灌胃12周后處死大鼠，腹腔內(nèi)注射40mg／kg 2%戊巴比妥鈉，再依次灌注生理鹽水（200～250mL）、4%多聚甲醛（350～400mL）。灌注完后即取左側(cè)股骨，用DEPC水處理后，密封包裹保存于液氮中；取出右側(cè)股骨用4%多聚甲醛固定24h（4℃條件下）。

2.6 免疫組化法檢測GABA、GABABRI 按試劑盒說明書進(jìn)行操作，應(yīng)用Image－ProPlus6.0醫(yī)學(xué)圖像分析軟件對表達(dá)結(jié)果進(jìn)行半定量分析，測量免疫陽性部位的平均光密度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較用單因素方差分析（one－wayANOVA）（方差齊時(shí)采用Tukey檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用 Dulmett＇sT3檢驗(yàn)）。

3 結(jié) 果 3.1 一般情況 給藥一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠反應(yīng)遲緩，懶動(dòng)，體態(tài)變得臃腫，皮毛發(fā)黃且欠光澤，而假手術(shù)組和補(bǔ)骨脂二氫黃酮給藥組大鼠則身形敏捷，反應(yīng)靈敏，皮毛光滑有光澤。灌胃結(jié)束后可能由于麻醉、灌胃等原因，一部分大鼠出現(xiàn)死亡，假手術(shù)組大鼠死亡1只，模型組死亡3只，補(bǔ)骨脂二氫黃酮給藥組死亡2只。

3.2 手術(shù)12周后測定各組大鼠股骨骨密度與尿鈣值手術(shù)12周后，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠股骨骨密度值下降（P＜0.05）；尿鈣值明顯升高（P＜0.01），這說明手術(shù)組大鼠的骨量明顯丟失，尿鈣大量排泄，同時(shí)提示OP模型復(fù)制成功。見表1。

表1 手術(shù)12周后各組大鼠股骨骨密度、尿鈣結(jié)果比較（±s）

表1 手術(shù)12周后各組大鼠股骨骨密度、尿鈣結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01

組 別 n 股骨骨密度（mg／cm2） 尿鈣（mmol／L）手術(shù)組 40 120.8±5.2△ 5.1±1.7▲20 131.6±4.4 2.8±0.5假手術(shù)組

3.3 灌胃12周后測定各組大鼠股骨骨密度與尿鈣結(jié)果灌胃12周后，與模型組比較，補(bǔ)骨脂二氫黃酮組大鼠股骨骨密度值升高（P＜0.05）；尿鈣排泄明顯減少（P＜0.01）。見表2。

表2 灌胃12周后各組大鼠股骨骨密度、尿鈣結(jié)果比較（±s）

表2 灌胃12周后各組大鼠股骨骨密度、尿鈣結(jié)果比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01

17 120.8±5.2 5.1±1.7假手術(shù)組 19 131.6±4.4△ 2.8±0.5▲補(bǔ)骨脂二氫黃酮給藥組18 128.9±4.2△ 2.9±0.6模型組▲

3.4 各組大鼠股骨組織GABA含量 見表3。

表3 各組大鼠骨組織GABA含量（±s）

表3 各組大鼠骨組織GABA含量（±s）

注：與模型組比較△P＜0.05

17 10mL 0.0306±0.0103假手術(shù)組 19 10mL 0.0182±0.0059△補(bǔ)骨脂二氫黃酮給藥組 18 50mg 0.0201±0.0131平均光密度模型組組別 n 劑量（／kg·d）△

3.5 各組大鼠骨組織GABABRI含量 見表4。

表4 各組大鼠骨組織GABABRI表達(dá)（±s）

表4 各組大鼠骨組織GABABRI表達(dá)（±s）

注：與模型組比較△P＜0.05

17 10mL 0.0169±0.0090假手術(shù)組 19 10mL 0.0109±0.0051△補(bǔ)骨脂二氫黃酮給藥組 18 50mg 0.0112±0.0058平均光密度模型組組別 n 劑量（／kg·d）△

4 討 論 OP是一種常見的老年性疾病，近年來，學(xué)者們對其研究較多［2－4］，目前研究認(rèn)為GABA是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，以GABA為遞質(zhì)的中樞突觸部位約占50%，GABA在生物體內(nèi)具有重要的生理功能，參與多種神經(jīng)生理活動(dòng)，己報(bào)道其具有調(diào)節(jié)血壓、促進(jìn)腦部血流、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、預(yù)防肥胖、促進(jìn)乙醇代謝（醒酒）、改善更年期綜合癥等生理活性［5］。祖國醫(yī)學(xué)將骨質(zhì)疏松稱為骨痿、骨痹，其病因歸類如下：①先天稟賦不足：由于父母體虛導(dǎo)致先天遺傳不足，孕育不足以致腎氣虧虛，腎精不足，髓空骨軟而發(fā)為本病；②飲食不節(jié)：脾為后天之本、氣血生化之源，若暴飲暴食、嗜欲偏食、飲酒過度等原因均可損傷脾胃，若脾胃長期受損，導(dǎo)致脾主運(yùn)化水谷精微的功能出現(xiàn)異常則可致機(jī)體臟腑、四肢百骸失于滋養(yǎng)，肌肉瘦削而發(fā)為本??；③久病失治：大病之后，臟氣損傷，失于調(diào)理，正氣虧虛難復(fù)，精氣虧耗，傷及五臟，最終必傷及腎而發(fā)為本病。補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifoliaL的干燥成熟果實(shí)，又名懷故子、川故子、黑故紙、破故紙，具有溫腎助陽，納氣，止瀉的功效。藥理實(shí)驗(yàn)研究表明其具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量、抗腫瘤、抗菌、雙向調(diào)節(jié)平滑肌以及雌激素樣作用，臨床廣泛用于治療腎虛腰膝痛、骨痿、骨痹，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，抗骨質(zhì)疏松的作用［6］。

從本次研究中發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨骨密度降低，尿鈣值升高，骨組織中GABA和GABABRI的含量增多。但當(dāng)用補(bǔ)骨脂二氫黃酮灌胃12周后發(fā)現(xiàn)給藥組大鼠股骨骨密度值升高，尿鈣值降低，骨組織GABA和GABABRI的含量明顯減少，但與假手術(shù)組比較無顯著性差異，說明補(bǔ)骨脂二氫黃酮可以增加OP模型大鼠的骨密度，降低了成骨的迫切性，使神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用減緩，減少了GABA及相關(guān)物質(zhì)的釋放。推測當(dāng)GABA在身體內(nèi)大量聚集但又不能及時(shí)被轉(zhuǎn)運(yùn)的情況下，GABA可能是通過GABABR抑制OB的活性，OP模型大鼠經(jīng)補(bǔ)骨脂二氫黃酮灌胃治療后股骨骨密度增加，尿鈣減少，骨組織中GABA、GABABRI含量均下降，這說明補(bǔ)骨脂二氫黃酮可能是通過GABA抑制OB活性這種途徑防治OP，這可能是補(bǔ)骨脂二氫黃酮治療OP的機(jī)制之一。

［1］ 謝義松，張紫銘，吳官保.等.虎潛丸對去印巢大鼠骨質(zhì)疏松模型骨密度及轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)正骨，2013，25（12）：11－14.

［2］ 李連弟，郭大江.補(bǔ)中益氣湯加味治療老年性骨質(zhì)疏松癥療效觀察［J］.陜西中醫(yī)，2013，33（12）：1625－1627.

［3］ 馬 偉，馬占洋，王福山，等.延經(jīng)丸對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清PTH、CT的影響［J］.陜西中醫(yī)，2012，33（12）：625－626.

［4］ 韓麗萍，魏敏惠，王相東，等.補(bǔ)腎活血方及其拆方對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度及組織形態(tài)的影響［J］.陜西中醫(yī)，2013，36（2）：85－87.

［5］ 劉志廣.腺苷A1受體在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用及其與GABA信號(hào)通路相關(guān)性的研究［D］.華中科技大學(xué)，2013，5.

［6］ 李 璘，邱蓉麗，樂 巍，等.補(bǔ)骨脂雌激素樣作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（4）：57－59.