張雪梅,趙錦慧,張永亮

致病性大腸桿菌是導(dǎo)致動(dòng)物患病的常見(jiàn)病原菌,常引起嚴(yán)重腹瀉、敗血癥等多種疾病,治療不及時(shí)常引起動(dòng)物死亡[1,2].長(zhǎng)期以來(lái),雖然抗生素對(duì)細(xì)菌性感染疾病的治療起主要作用,但隨著抗生素逐漸更新?lián)Q代及不合理應(yīng)用,病原菌的耐藥性日益增強(qiáng),西藥治療效果逐步減退[3].中草藥不僅可以通過(guò)提高機(jī)體的免疫力而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗力,還較少產(chǎn)生抗藥性和耐藥性,對(duì)機(jī)體的毒害也相對(duì)較小,因此用作畜禽細(xì)菌性疾病的防治或畜禽飼料添加劑有很好的應(yīng)用前景[4-6].通常具備清熱解毒功效的中草藥在體外大多顯示一定的抗菌活性[7].本試驗(yàn)選取鬼針草等6種常見(jiàn)的清熱解毒中草藥,研究其復(fù)方中草藥制劑對(duì)致病性大腸桿菌的體外抑菌活性,旨在為開(kāi)發(fā)綠色、環(huán)保、抗菌中草藥制劑及動(dòng)物細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療提供科學(xué)的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

中藥材:鬼針草、鼠曲草、魚(yú)腥草、絞股藍(lán)、牡丹皮、墨旱蓮,購(gòu)于周口市開(kāi)心人大藥店.

供試菌種:大腸桿菌,由周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院提供.

1.2 儀器和試劑

儀器:電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平等.

試劑:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基).

1.3 方法

1.3.1 復(fù)方中草藥提取液的制備[8,9]

第1組取鬼針草25 g,鼠曲草15 g,魚(yú)腥草20 g;第2組取墨旱蓮25 g,絞股藍(lán)15 g,牡丹皮20 g.每組中各加入400 m L的蒸餾水,文火加熱煮沸1 h,用紗布過(guò)濾后得提取液,濾渣用4倍水量煎煮2次后棄去,將3次所得濾液混合并濃縮到60 m L,使提取原液濃度達(dá)到1 g/m L.第3組取鬼針草25 g,鼠曲草15 g,魚(yú)腥草20 g,絞股藍(lán)15 g;第4組取鼠曲草15 g,絞股藍(lán)15 g,牡丹皮20 g,墨旱蓮25 g,同法將每組3次所得提取液濃縮至75 m L;第5組取鬼針草25 g,鼠曲草15 g,魚(yú)腥草20 g,絞股藍(lán)15 g,牡丹皮20 g;第6組取鼠曲草15 g,魚(yú)腥草20 g,絞股藍(lán)15 g,牡丹皮20 g,墨旱蓮25 g,同法使每組的3次濾液濃縮至95 m L;第7組取鬼針草25 g,鼠曲草15 g,魚(yú)腥草20 g,絞股藍(lán)15 g,牡丹皮20 g,墨旱蓮25 g,同法將3次所得濾液濃縮至120 m L.最終各組提取液濃度均為1 g/m L,所得提取液在121℃下高壓蒸汽滅菌20 min后,4℃保存?zhèn)溆?

1.3.2 普通細(xì)菌培養(yǎng)基的制備

固體培養(yǎng)基:制備牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)[10].

液體培養(yǎng)基:制備營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[11].

1.3.3 菌種活化及菌懸液的制備

在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌接種環(huán)從試管斜面上挑取大腸桿菌少許接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37℃活化培養(yǎng)24 h[12].挑取活化后的大腸桿菌的單個(gè)菌落放入無(wú)菌生理鹽水中制備成菌懸液,調(diào)節(jié)菌液稀釋度,用平板菌落計(jì)數(shù)法[13]測(cè)定其菌體密度,菌體密度達(dá)到102cfu/m L的菌懸液即為本試驗(yàn)合適的供試菌懸液.

1.3.4 抑菌率的測(cè)定

在超凈工作臺(tái)內(nèi),將經(jīng)過(guò)加熱熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中,凝固成平板待用.將各組復(fù)方中草藥提取原液與大腸桿菌菌懸液按比例混合配制混合液,使混合液中藥液含量分別為500 mg/m L和250 mg/m L,分別取各種混合液0.2 m L,涂布平板,用無(wú)菌生理鹽水做對(duì)照.將涂布好的平板放置30 min后倒置,然后放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù),計(jì)算抑菌率.[14].涂布平板時(shí)每種藥液稀釋度設(shè)置5個(gè)重復(fù),抑菌率用5次重復(fù)的平均值表示.

1.3.5 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

采用二倍稀釋法[15,16],將7組復(fù)方中草藥提取液分別用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋,稀釋后的藥液培養(yǎng)基濃度分別為500 mg/m L,250 mg/m L,125 mg/m L.MIC的測(cè)定:在裝有1 m L藥液培養(yǎng)基的各管中加入0.1 m L的菌懸液(菌懸液的菌體密度為102cfu/m L),混勻,37℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果,以試管中無(wú)渾濁現(xiàn)象出現(xiàn)的最低藥液濃度作為MIC,實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照管.MBC的測(cè)定:在MIC測(cè)定的基礎(chǔ)上,從未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的各管培養(yǎng)物中吸取0.1 m L涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,37℃條件下培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果,以仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的管內(nèi)藥物濃度記為該藥物的MBC.

1.3.6 藥敏紙片法測(cè)抑菌圈直徑

中草藥提取液抑菌圈測(cè)定采用藥敏紙片法[17],選取吸水性較好的濾紙,用打孔器制成直徑為6 mm的圓形濾紙片,高壓蒸汽滅菌后備用.在超凈工作臺(tái)上將熔化后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒平板,每皿大約15～20 m L,凝固后備用.用無(wú)菌吸管吸取0.1 m L菌懸液滴入備好的平板中,用涂布棒將菌懸液涂布均勻.將制備好的圓形濾紙片在各組復(fù)方中草藥提取原液(濃度為1 g/m L)中浸泡1 h,用無(wú)菌鑷子夾取浸透藥液的濾紙片,瀝去多余的藥液后將其貼于上述制備好的含菌平板上,每個(gè)平板上貼5片,并用無(wú)菌生理鹽水做對(duì)照,然后將平板置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)量抑菌圈直徑,比較各組的抑菌效果.

藥敏紙片法可參考以下標(biāo)準(zhǔn)記錄結(jié)果:抑菌圈直徑為16～20 mm,表示高度敏感;11～16 mm,表示中度敏感;10～11 mm表示輕度敏感;＜10 mm,表示不敏感.

2 結(jié)果與分析

2.1 7組復(fù)方中草藥提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌率

表1 不同濃度的復(fù)方中草藥提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

7組復(fù)方中草藥提取液在不同濃度下對(duì)大腸桿菌的抑菌率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可知:7組復(fù)方中草藥提取液在不同濃度下對(duì)大腸桿菌均有不同程度的抑制作用.第1組、第2組、第4組、第5組、第6組隨提取液濃度的增加,抑菌率呈上升趨勢(shì);第3組、第7組隨提取液濃度的增加,抑菌率呈下降趨勢(shì).當(dāng)提取液濃度為500 mg/m L時(shí),第4組和第6組的抑菌率均達(dá)到90%以上;當(dāng)提取液濃度為250 mg/m L時(shí),第3組的抑菌率達(dá)到90%以上.上述結(jié)果表明,不同中草藥配伍對(duì)大腸桿菌的抑制效果不同,但復(fù)方中草藥提取液濃度與抑菌效果之間并非正相關(guān),有些復(fù)方中草藥在低濃度下反而對(duì)大腸桿菌抑制效果好.

2.2 7組復(fù)方中草藥提取液對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

表2 不同濃度的復(fù)方中草藥提取液作用下大腸桿菌的生長(zhǎng)情況

表3 7組復(fù)方中草藥提取液對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度與最小殺菌濃度

在不同濃度的復(fù)方中草藥提取液作用下大腸桿菌的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2.從表2可以看出,第1組、第2組、第5組在3個(gè)濃度下,大腸桿菌均有生長(zhǎng),第4組、第6組在500 mg/m L的濃度下,試管內(nèi)無(wú)渾濁現(xiàn)象,第3組在250 mg/m L和125 mg/m L的濃度下,試管內(nèi)均無(wú)渾濁現(xiàn)象,第7組在125 mg/m L的濃度下,試管內(nèi)無(wú)渾濁現(xiàn)象.這說(shuō)明第1組、第2組、第5組對(duì)大腸桿菌抑制效果較差,第4組、第6組在高濃度下對(duì)大腸桿菌抑制效果較好,而第3組、第7組在低濃度下對(duì)大腸桿菌抑制效果較好.此研究結(jié)果與上述抑菌率統(tǒng)計(jì)結(jié)果相似.最小抑菌濃度的測(cè)定,也能在一定程度上反映7組不同的中草藥配伍對(duì)大腸桿菌的抑菌性能.

從MIC測(cè)定中試管內(nèi)無(wú)渾濁現(xiàn)象出現(xiàn)的各管中吸取0.1 m L培養(yǎng)物涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,37℃條件下培養(yǎng)24 h后,觀察結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可知,第3組、第7組的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為125 mg/m L,剩余幾組平板上仍然有大腸桿菌生長(zhǎng).

2.3 7組復(fù)方中草藥提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑

7組復(fù)方中草藥提取液在1 g/m L濃度下對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4.由表4可知:7組復(fù)方中草藥提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑各不相同,大腸桿菌對(duì)第4組、第6組復(fù)方中草藥提取液表現(xiàn)中度敏感,對(duì)第1組、第2組復(fù)方中草藥提取液表現(xiàn)輕度敏感,對(duì)第3組、第5組、第7組復(fù)方中草藥提取液表現(xiàn)不敏感.這與上述抑菌率、最小抑菌濃度研究結(jié)果基本一致.

表4 7組復(fù)方中草藥提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同中草藥配伍對(duì)大腸桿菌的抑菌、殺菌效果不同,同一種中草藥配伍下,復(fù)方中草藥提取液濃度對(duì)抑菌效果影響明顯.第1組、第2組、第5組對(duì)大腸桿菌抑制效果較差,第4組、第6組在高濃度下對(duì)大腸桿菌抑制效果較好,第3組、第7組在低濃度下對(duì)大腸桿菌抑制效果較好.

7組復(fù)方中草藥提取液對(duì)大腸桿菌均有不同程度的抑制作用,但其抑菌、殺菌效果有明顯差異.其原因可能有以下幾個(gè)方面:①中草藥中能夠抑菌的有效成分主要是各種精油、酚類(lèi)、生物堿和黃酮類(lèi)等物質(zhì)[18],中草藥所含的有效成分不同決定了其抑菌效果;②多種藥物聯(lián)合使用后,藥物中能夠抑菌的有效成分增多,可能就會(huì)使抑菌效果增強(qiáng)[19];③不同中草藥含有的有效成分對(duì)菌體的作用機(jī)制有差異,他們可能會(huì)作用于細(xì)菌生長(zhǎng)的不同階段,所以復(fù)方中草藥制劑可以發(fā)揮綜合調(diào)控的作用[20];④不同中草藥之間可能會(huì)發(fā)生一些化學(xué)反應(yīng)改變某些有效抑菌成分,從而導(dǎo)致復(fù)方中草藥制劑抑菌效果減弱;⑤不同中草藥配伍后,并不是所選用的藥物濃度越高抑菌效果就越好,可能是各種有效抑菌成分之間存在合適配比的問(wèn)題.

目前對(duì)于單味中草藥抑菌效果研究較多[2123],但對(duì)于復(fù)方中草藥制劑抑菌性能及抑菌機(jī)理方面的研究比較少[24].因此,綠色環(huán)保抗菌中草藥復(fù)方制劑有非常廣泛地研究、開(kāi)發(fā)和利用前景.

每種中草藥由于其來(lái)源、季節(jié)性變化、植物部位、提取方法不同均會(huì)影響其抑菌效果,多種中草藥配伍后,其抑菌性能的影響因素更加復(fù)雜,這為開(kāi)發(fā)與研制復(fù)方中草藥殺菌劑帶來(lái)了一定的難度,因此需要進(jìn)行更多地研究.

參考文獻(xiàn):

[1]孫力軍,陳玲玲,李春保.黃連等六味中藥對(duì)雙歧桿菌和大腸桿菌體外生長(zhǎng)的影響[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2004(1):7-9.

[2]胥洪燦,宋友文.幾種中草藥對(duì)大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].四川畜牧獸醫(yī),2004,31(3):22-26.

[3]汪業(yè)菊.中藥抑菌機(jī)制研究[J].科技向?qū)?2012(1):54-55.

[4]曹翠萍,寧海強(qiáng),孫麗,等.中藥對(duì)大腸桿菌抑制作用及耐藥性誘導(dǎo)作用的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,20(5):1101-1104.

[5]蔣芬芳,胡仕鳳,董偉,等.復(fù)方中草藥添加劑對(duì)保育仔豬生長(zhǎng)性狀影響及對(duì)大腸桿菌體外抑菌試驗(yàn)的研究[J].湖南畜牧獸醫(yī),2009(5):8-9.

[6]司紅彬,梁松林,許桂芹,等.4味中藥及其與抗菌藥的復(fù)方制劑的MIC測(cè)定[J].中國(guó)獸藥雜志,2006,40(2):31-34.

[7]劉英姿,羅有梁.中藥止瀉散及其單味中藥體外抑菌試驗(yàn)[J].獸藥疫苗,2005(7):43-44.

[8]丁鳳榮,邱世翠,郭麗華,等.牡丹皮的體外抑菌作用研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2003,14(8):452.

[9]萬(wàn)永紅,周向?qū)?八種中草藥抑菌試驗(yàn)報(bào)告[J].生物學(xué)雜志,1999,16(2):31-32.

[10]邵偉,熊澤,黎姝華,等.磁場(chǎng)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2000,27(2):112-114.

[11]萬(wàn)軍庭,唐李斐,鐘靖,等.大腸桿菌K12不同生長(zhǎng)時(shí)期培養(yǎng)液和溶漿對(duì)其生長(zhǎng)的影響[J].氨基酸和生物資源,2005,27(3):71-73.

[12]蔡年春,胡仁火,李亞男,等.六種中草藥提取液的抑菌殺菌作用研究[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(bào),2009,29(3):130-131.

[13]胡仁火.五種中草藥提取液對(duì)細(xì)菌作用效果初探[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(bào),2006,26(6):134-135.

[14]馬萬(wàn)霞,胡仁火,王娟,等.五種中草藥提取液抑菌殺菌作用的研究[J].長(zhǎng)江工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,26(3):52-53.

[15]王瑞君.幾種中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌體外抑菌作用的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(9):1104-1106.

[16]周威,李景玉,王國(guó)培,等.數(shù)種中藥抑制金黃色葡萄球菌作用比較[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,22(1):109-110.

[17]劉英姿,羅有梁.中藥止瀉散及其單味中藥體外抑菌試驗(yàn)[J].獸藥疫苗,2005(7):43.

[18]方建茹,龍凱,謝小梅.中藥抗真菌的研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志,2009,35(3):60-61.

[19]鄭全喜,蘇顯中,王河清,等.中草藥體外抑菌作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù),2009,4(4):295-298.

[20]李晶,景立,劉洋,等.國(guó)內(nèi)抗菌中藥的研究進(jìn)展及前景[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2009(12):86-88.

[21]潘明.鼠曲草提取物抑菌作用初步研究[J].四川食品與發(fā)酵,2006,42(6):53-56.

[22]陳建中,葛水蓮,肖玉菲.菊科植物鬼針草浸提物抑菌活性研究[J].北方園藝,2012(21):83-84.

[23]王育紅,李風(fēng)學(xué),張志清,等.24種中藥水煎劑與免煎顆粒劑對(duì)臨床菌株的體外抑菌作用[J].江蘇中醫(yī)藥,2006,27(4):52-54.

[24]董發(fā)明,王天奇,夏海林.楊樹(shù)花及其復(fù)方制劑對(duì)兔大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2007(4):35-36.