楊圣賢，楊正明，陳奕軍，黃艷菲，何麗華，張志鋒，陳 蓉

（1.西南民族大學民族醫(yī)藥研究院，成都 610041；2.湖南師范大學醫(yī)學院，長沙 410013）

黃精為百合科黃精屬植物，始載于《名醫(yī)別錄》，其來源為滇黃精Polygonatum kingianum CoLL.et HemsL、黃精P.sibiricum Red 或多花黃精P.cyrtonema Hua 的干燥根莖。多為本草生植物，按形狀不同，習稱“大黃精”、“雞頭黃精”、“姜形黃精”。性味甘、平，入脾、腎、肺經，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎［1］等功能，用于滋補強身，腎虛精虧，肺虛燥咳以及脾胃虛弱之證，是中醫(yī)常用滋補強壯藥，研究發(fā)現(xiàn)黃精尚具有降血壓、降血糖、降血脂［2］、抗腫瘤［3］。

黃精的炮制方法多達二十余種，其中以蒸煮法為主，如單蒸、重蒸、九蒸九曝、加輔料蒸制等，近代炮制方法還有黑豆制，熟地制，蜂蜜制，生姜制等。由于生黃精具有麻味，服用生品時，口舌麻木，刺激咽喉。所以蒸制最早的目的是去除其刺激性，便于長期保存。在《中藥炮制大全》和《中國藥典》（2010 版）中均沒有對黃精九蒸九制炮制方法的記錄，現(xiàn)代學者朱衛(wèi)平［4］提出了“潤、蒸、燜、拌汁”的新方法，劉超［5］等對黃精炮制法提出改進即“潤－蒸－燜”，龐玉新［6］、吳文遠［7］等也對黃精炮制方法提出了不同程度的改進，但他們均沒有涉及到九蒸九制黃精的炮制方法。目前也鮮有對黃精九蒸九制的炮制機理進行研究的文獻，因此本文通過紫外-可見分光光度法來探究黃精九蒸九制過程中每一蒸制多糖和皂苷含量的變化，擬從多糖和皂苷的含量隨蒸制次數增加的變化規(guī)律來考證九蒸九制的炮制機理和意義，為黃精的質量標準提供依據。

1 材料、試劑與儀器

黃精、葡萄糖對照品、薯蕷皂苷元對照品（中國藥品檢驗所，批號1405106），香草醛、蒽酮、冰醋酸、高氯酸、濃硫酸、氯仿、甲醇、乙醇以及其他試劑均為分析純，水為純凈水。

DHG-9246 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；KQ-250B 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240S 梅特勒電子分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；IKA RV8 V 型旋轉蒸發(fā)儀（艾卡（廣州）儀器設備有限公司（IKA 中國））；HX-200 型高速中藥粉碎機（浙江永康溪岸五金藥具廠）；TGL-16 型臺式高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）。普析TU-1950 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

2 方法與結果

2.1 樣品制備將新鮮的黃精去除雜質及須根，洗凈晾干，切厚片，分九份并做好標記。稱量并記錄新鮮黃精重量，然后將其清蒸6 小時，取出放入45℃的烘箱內，烘至重量不再減少。重復操作9 次，分別得到1，2，3……9 蒸制黃精，九蒸九制過程中黃精的重量變化如圖1 所示?？瞻捉M是新鮮黃精直接烘干即稱為0 蒸。

圖1 黃精九蒸九制過程中重量的變化

由圖1 可知，在九蒸九制過程中，黃精樣品在一蒸一制后重量明顯減少，大約減少了70%左右，之后黃精樣品的質量減少緩慢。

2.2 多糖的測定

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品20.25mg，置于100mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2025mg/mL 的對照品溶液。

2.2.2 標準曲線的繪制分別精密吸取“2.2.1”項下葡萄糖對照品溶液0.08mL、0.12mL、0.16mL、0.20mL、0.24mL、0.28mL、0.32mL、0.36mL、0.40mL，分別置于具塞比色管中，依次加蒸餾水至2.0mL，加入新鮮配置的2%的蒽酮-硫酸4mL，搖勻，立即放入沸水中10min，取出，立即在冰水浴中10min，以蒸餾水為空白溶劑同法操作作為空白對照，在624nm 處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.0168x+0.0549，R2=0.9998，在4.05～40.5μg/mL 范圍內吸光度與質量濃

度線性關系良好。

2.2.3 樣品溶液的制備準確稱取0～9 蒸的黃精粉末1.0g，分別置于100mL 的圓底燒瓶中，加入95%乙醇40mL，在80℃的恒溫水浴鍋內回流1h，除去脂溶性成分，過濾，揮干乙醇，分別加20mL 蒸餾水，置75℃的恒溫水浴鍋內回流提取2.5h，趁熱過濾，殘渣用蒸餾水洗滌3 次，合并濾液和洗液，減壓濃縮其體積的1/5 倍，加相當于溶液體積6 倍的無水乙醇，多糖呈絮狀沉淀析出，靜置24h，離心，過濾，得到黃精的粗多糖，45℃烘干。取適量粗多糖用蒸餾水溶解定容至50mL，搖勻，即得。

2.2.4 九蒸九制黃精中多糖含量的測定準確吸取一定量的2.2.3 制備的黃精多糖溶液，按照“2.2.2”顯色條件測其吸光度（Y），由回歸方程計算多糖溶液的濃度，計算黃精中多糖的含量。

圖2 0～9蒸黃精的多糖含量變化

由圖2 可知，直接烘干的0 蒸黃精多糖含量為12%，九蒸九制過程中，1 蒸黃精的多糖含量為8.89%，1～3 蒸間多糖含量明顯減少，3～9 蒸間多糖的含量趨于穩(wěn)定，基本在1%左右。

2.3 皂苷的含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的薯蕷皂苷元對照品5.11mg，置于10mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.511mg/mL 的對照品溶液。

2.3.2 標準曲線的繪制分別精密吸取“2.3.1”項下薯蕷皂苷元對照品溶液0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.70mL，分別置于具塞比色管中，60℃的水浴鍋揮干，加入新鮮配置的5%的香草醛冰醋酸0.2mL，高氯酸0.8mL，搖勻，立即放入60℃的水浴鍋10min，取出，立即在冰水浴中5min，取出，加5mL冰醋酸，以不加空白溶劑同法操作作為空白對照，在545nm 處測定吸光度。以薯蕷皂苷元質量濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y=12.097x+0.0918，R2=0.9996，在4.25～59.62μg/mL 范圍內吸光度與質量濃度線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗精密吸取薯蕷皂苷元對照品溶液6 份各0.7mL，按標準曲線繪制方法操作，測定吸光度。RSD=1.31%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗取供試品溶液1mL，按對照品溶液測定方法，在0，0.5，1，1.5，2h 測定一次吸光度，RSD=1.1%。結果表明，供試品在2 h 以內穩(wěn)定，測量結果準確。

2.3.5 重復性試驗取供試品溶液，按對照品溶液測定方法，重復測定6 次，RSD=0.19%。結果表明，此法的重復性良好。

2.3.6 加樣回收率精密吸取已知9 蒸黃精皂苷溶液0.02mL，平行6 次，各加入薯蕷皂苷元對照品溶液0.181mL，測定總皂苷含量，計算回收率，結果：平均加樣回收率是103.00%，RSD 為5.39%。

2.4 超聲輔助提取工藝

2.4.1 溶劑單因素考察考慮到以往最常用的皂苷提取溶劑，試驗以75%甲醇、甲醇、75%乙醇、95%乙醇為溶劑，采用超聲輔助提取方法，平行試驗，以皂苷的含量為指標，初選提取溶劑，結果：以75%甲醇提取的皂苷含量為11.24%，甲醇的為11.09%，75%乙醇的為12.08%，95%乙醇的為9.13%。結果表明95%乙醇和甲醇對于本品提取效果較差，75%乙醇對皂苷的提取效果最好，因此我們選用75%乙醇作為提取溶劑。

2.4.2 正交試驗根據單因素試驗結果和影響超聲輔助提取的主要參數，選取提取溶劑（A）、浸提溫度（B）、提取時間（C）、提取次數（D）作為考察因素，每個因素選用3 個水平，確定因素水平見表1，以黃精皂苷含量為考察指標，采用正交表L9（34）進行試驗，按照正交表的條件對二蒸二制的黃精進行提取，具體操作方法如下：取黃精1.00g，加乙醇15mL，浸提，超聲，過濾，減壓濃縮至干，適量甲醇溶解，離心，轉移到25mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得，準確吸取皂苷溶液0.04ml，按照“2.3.2”顯色條件測其吸光度（Y），由回歸方程計算皂苷溶液的濃度，計算黃精中皂苷的含量。正交試驗結果見表2。

表1 因素水平表

表2 黃精總皂苷正交試驗表

表2 結果表明，提取次數（D）和浸提溫度（B）對中皂苷的含量影響最大，提取時間（C）對黃精中總皂苷的含量影響最小。因此可以得出4 個因素對提取黃精中皂苷的主次影響順序為B=D＞A＞C，確定黃精中皂苷含量的最佳提取工藝為D3B3C3A1，即85%乙醇，浸提溫度70℃，超聲時間40min，超聲一次。

2.4.3 驗證試驗按照上述最佳優(yōu)化工藝進行驗證試驗，重復3 次，黃精中皂苷含量的平均值為167.76mg，RSD=1.76%，表明該工藝重現(xiàn)性良好。

2.4.4 皂苷含量測定準確稱取以上炮制的0～9 蒸黃精細粉末各1.00g，按最佳超聲輔助提取工藝組合進行提取，準確吸取一定的黃精皂苷溶液，按照“2.3.2”顯色條件測其吸光度（Y），由回歸方程計算總皂苷溶液的濃度，計算 ～ 蒸黃精中皂苷的含量。

圖3 0～9蒸黃精超聲輔助提取總皂苷含量變化曲線

由圖3 可知，超聲輔助提取的0～4 蒸黃精皂苷的含量增加明顯，增加了近7 倍，而4～9 蒸皂苷含量趨于穩(wěn)定，約為14%左右。

3 討論

0～9 蒸黃精的多糖、皂苷提取液的顏色有明顯的不同，0 蒸黃精的提取液為無色，1～4 蒸逐漸變成紅褐色，4～9 蒸為紅褐色，這種顏色是否對紫外分光光度檢測有影響。雖然9 蒸的多糖含量和4 蒸的一樣，但是是否4 蒸黃精的藥用效果也和9 蒸的一樣，這個需要做進一步的研究。在何首烏的清代《藥品辨義》中記載：“久蒸制熟，成紫黑色”。筆者不禁想問九蒸九制是否在古代是久蒸久制，九蒸九制中的九僅僅代表的只是蒸制時間的長短，并非是說蒸制九次，也可以認為九是最大的一位數，九蒸九制還是強調蒸制時間的長短而并非蒸制的次數，這有待于進一步的考證。

直接烘干的黃精多糖含量最高，炮制過后多糖含量有明顯的降低，這是因為多糖大量水解成低聚糖、單糖，有利于有效成分的煎出及藥效的充分發(fā)揮，單從多糖的含量上，9 蒸黃精和4 蒸的多糖含量基本一樣。得到直接烘干的0 蒸黃精中皂苷含量最少，炮制后的皂苷含量逐步增加，四蒸四制后皂苷含量就基本穩(wěn)定。單從皂苷含量上，黃精四蒸四制就可以，所以綜合多糖和皂苷的含量考慮，四蒸四制的黃精最好。采用正交試驗設計方法，得到黃精皂苷超聲輔助最佳提取工藝，即85%乙醇，浸提溫度70℃，超聲時間40min，超聲一次。超聲輔助提取與傳統(tǒng)的醇提法相比，可以縮短提取時間，節(jié)省溶劑，提高有效成分的提取效率，簡化提取操作步驟。在現(xiàn)代文獻中黃精的炮制以蒸制為主，同時出現(xiàn)了各種減少蒸制次數的方法，但關于炮制工藝的標準并不相同，蒸制和烘干的次數也不相同，相互間也沒有比較，希望本文為黃精的九蒸九制炮制工藝提供理論支持。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.一部.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.288.

［2］ 黃瑤, 石林.黃精的藥理研究及其開發(fā)利用［J］.華西藥學雜志,2002, 17(4): 278-279.

［3］ Liu B, Cheng Y, Bian HJ, et al.Molecular mechanisms of polygonatum cyrtonema lectin-induced apoptosis and autophagy in cancer cells［J］.Autophagy, 2009, 5(2): 253-255.

［4］ 朱衛(wèi)平.黃精炮制經驗［J］.中成藥研究, 1986, 14(12): 42.

［5］ 劉超, 李紀真, 賈會剛, 等.改進黃精炮制方法［J］.時珍國醫(yī)國藥,2000, 11(11): 991.

［6］ 龐玉新, 趙致, 冼富榮.黃精的炮制研究［J］.時珍國醫(yī)國藥, 2006,17(6): 920-992.

［7］ 吳遠文.淺談中藥炮制的“不及”與“太過”［J］.中藥材, 1992, 15(8): 47.