高鳳娟, 李丕鵬, 陸宇燕

(沈陽師范大學(xué) 兩棲爬行動物研究所, 沈陽 110034)

?

花背蟾蜍皮膚結(jié)構(gòu)及其抗氧化和免疫功能的研究

高鳳娟, 李丕鵬, 陸宇燕

(沈陽師范大學(xué) 兩棲爬行動物研究所, 沈陽 110034)

為了深入了解花背蟾蜍(Bufo raddei Strauch)皮膚顯微結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能,利用石蠟切片及酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)技術(shù),觀察了花背蟾蜍背腹側(cè)皮膚及其皮膚腺的顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn),分別測定了背、腹側(cè)皮膚中SOD、CAT、MDA、TLR4和βD-1含量。結(jié)果:花背蟾蜍皮膚結(jié)構(gòu)與其他兩棲類皮膚結(jié)構(gòu)基本相同,其角質(zhì)層腹側(cè)較背側(cè)厚,表皮和真皮背側(cè)較腹側(cè)厚;顆粒腺主要存在于背側(cè),而黏液腺主要存在于腹側(cè)。SOD和TLR4含量腹側(cè)皮膚高于背側(cè)皮膚;CAT含量背側(cè)皮膚較腹側(cè)高;MDA和βD-1含量在背腹皮膚中相近。結(jié)論:花背蟾蜍皮膚結(jié)構(gòu)和相關(guān)蛋白水平能夠較好的適應(yīng)其生境,并具有一定的抗氧化能力和天然免疫功能。

花背蟾蜍; 皮膚; 顯微結(jié)構(gòu); SOD; TLR4;βD-1

0 引 言

脊椎動物的皮膚對機(jī)體有著重要的保護(hù)作用,而兩棲類由于一心室兩心房的特殊結(jié)構(gòu),皮膚在氣體交換中也承擔(dān)著不可忽視的作用。另外,近年的研究指出,兩棲類皮膚腺體可以分泌大量的抗菌肽[1-3],以防御外界微生物的侵入。雖然對兩棲類皮膚結(jié)構(gòu)已有很多報(bào)道[4-7],但未見對東北地區(qū)花背蟾蜍皮膚結(jié)構(gòu)、皮膚抗氧化酶和皮膚與天然免疫有關(guān)物質(zhì)的研究報(bào)道。

花背蟾蜍是東北地區(qū)的廣布種,已經(jīng)廣泛運(yùn)用于生物學(xué)的研究[8-11]。國內(nèi)對其皮膚的研究僅見對花背蟾蜍蝌蚪發(fā)生類壞死的皮膚在恢復(fù)過程中的超微結(jié)構(gòu)、花背蟾蜍角膜和皮膚蛋白質(zhì)組分的分析、花背蟾蜍耳后腺結(jié)構(gòu)的研究和蝌蚪發(fā)育過程中皮膚的結(jié)構(gòu)變化[12-15]。本研究旨在深入了解花背蟾蜍皮膚的結(jié)構(gòu)、抗氧化和免疫功能的基本特點(diǎn),為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ),并進(jìn)一步豐富花背蟾蜍的生物學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

成體花背蟾蜍5只,2014年5月采自沈陽北陵公園小湖,均為產(chǎn)卵后的個體,體重為(12±0.21) g,體長為(50±0.45) mm。實(shí)驗(yàn)室條件下暫養(yǎng)10日左右,其間喂以面包蟲。

1.2 方 法

1.2.1 形態(tài)學(xué)

以適量的乙醚將實(shí)驗(yàn)用花背蟾蜍麻醉后,在軀干前后肢間進(jìn)行皮膚的環(huán)剝。環(huán)剝下來的皮膚放置在冰盒(培養(yǎng)皿中放置碎冰,在其上再放置潔凈的載玻片)上進(jìn)行分類處理。

背腹近中線處左側(cè)各取3 cm×0.5 cm的皮膚固定于10%的中性福爾馬林溶液中,常規(guī)石蠟切片,厚7 μm,H.E染色和AB-PAS染色。利用OLYMPUS BX51-DP71顯微鏡進(jìn)行顯微觀察和照相,Image-Pro Express 6.0進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的測量。

1.2.2 相關(guān)酶含量測定

完成上述取材后的剩余背、腹皮膚分別加入含有一定量的預(yù)冷任氏液(4 ℃)的離心管中剪碎,利用BD-1200非接觸式超聲波破碎儀(水循環(huán)制冷)進(jìn)行破碎,利用TGL-16G-C型冷凍離心機(jī)離心(9 000 r/min)10 min取上清,保持于中科美菱超低溫冰柜(-86 ℃)冰凍備用。選用魚抗的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒,利用TECAN infinite F50型酶標(biāo)儀分別測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、TOll樣受體4(TLR4)、β-防御素1(βD-1)的含量。實(shí)驗(yàn)所用試劑盒均購自北京鼎國試劑公司,嚴(yán)格按照說明書步驟操作。

1.2.3 計(jì)算公式與數(shù)據(jù)處理

參照李洋[16]計(jì)算腺體的數(shù)量密度方法計(jì)算花背蟾蜍背腹皮膚中腺體的數(shù)量密度,計(jì)算公式為:數(shù)量密度=腺體個數(shù)/(腺體平均直徑×材料平均長度)個/mm2。

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0分析,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,不符合正態(tài)分布的進(jìn)行非參檢驗(yàn),描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 顯微結(jié)構(gòu)

花背蟾蜍皮膚的基本結(jié)構(gòu)與其他兩棲類皮膚相似,可分為表皮層和真皮層。

2.1.1 表皮

在表皮細(xì)胞最外層是一層由死亡的角質(zhì)細(xì)胞及其分泌物共同構(gòu)成的角質(zhì)膜,其表面光滑、厚薄均勻,H.E染色呈透明的淡紫色,與角質(zhì)化細(xì)胞連接緊密,僅局部區(qū)域與角質(zhì)化細(xì)胞脫離(圖1)。表皮呈為復(fù)層扁平上皮,最外層的角質(zhì)化細(xì)胞呈梭形,H.E染色胞質(zhì)呈伊紅色,胞核較小、梭形,深藍(lán)紫色。有些細(xì)胞已看不見其核的存在。

(a)—背側(cè)皮膚HE染色; (b)—腹側(cè)皮膚HE染色; (c)—背側(cè)皮膚AB-PAS反色; (d)—腹側(cè)皮膚AB-PAS染色。SC-角質(zhì)層; TL-過渡層; SB—基底細(xì)胞; PC-色素層; SCp—致密層; SS—疏松層; MG—黏液腺; GG—顆粒腺。

表皮最內(nèi)層的基底細(xì)胞呈長柱狀或橢圓形,排列整齊,H.E染色胞質(zhì)呈淡藍(lán)紫色,胞核位于細(xì)胞中部,橢圓形,深染。在表皮的基底細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞之間有1～3層的過渡細(xì)胞,此區(qū)域由內(nèi)往外可見細(xì)胞呈橢圓形、扁橢圓形以及梭形的過渡變化。H.E染色中胞質(zhì)也由淺藍(lán)色、淺紫色至尹紅色的過渡。胞核深染,由內(nèi)向外細(xì)胞核逐漸變小,形狀由長橢圓形逐漸變成梭形,有些細(xì)胞核周呈空泡狀。在表皮中有色素顆粒分布,常見于背側(cè)皮膚基底細(xì)胞層上方區(qū)域,腹側(cè)皮膚少見。

2.1.2 真 皮

花背蟾蜍真皮疏松層的疏松結(jié)締較為稀薄,僅在腺體周圍清晰可見,H.E 呈淺粉色,AB-PAS染色呈藍(lán)色。疏松層近基底細(xì)胞基膜處和皮膚腺周圍分布有較多的毛細(xì)血管。黑色素細(xì)胞主要分布于表皮與真皮疏松層之間,且呈大小不均勻的連續(xù)的斑塊狀分布,在疏松層中偶爾也可見色素細(xì)胞的分布。背側(cè)皮膚色素層明顯較腹側(cè)密集。 真皮致密層由大量波浪狀平行排列的膠原纖維束構(gòu)成,H.E染色呈淡紅色。在這些平行排列的膠原纖維中,每隔一定距離都有一些較細(xì)的纖維束垂直于皮膚表面分布,并為平行排列的膠原纖維提供附著。在膠原纖維間可見大量的成纖維細(xì)胞,細(xì)胞及胞核均呈梭形,胞質(zhì)淡紅色,胞核深藍(lán)紫色。

表1 花背蟾蜍背腹側(cè)皮膚各層厚度及腺體密度

注:同一列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

由表1可見,花背蟾蜍背腹側(cè)皮膚各層之間均具有明顯的差異。背側(cè)皮膚最表層的角質(zhì)層厚是腹側(cè)的89.23%,二者之間成顯著性差異。背側(cè)真皮疏松層厚為腹側(cè)的94.87%,二者間無顯著性差異。背側(cè)表皮層厚是腹側(cè)的130.58%,二者間呈極顯著性差異,而背側(cè)表皮的基底細(xì)胞厚是腹側(cè)的148.28%,二者間也呈極顯著性差異。背側(cè)皮膚致密層的厚是腹側(cè)的158.17%,二者呈極顯著性差異。

2.1.3 腺體

皮膚腺體屬泡狀腺,腺泡分布于真皮疏松層中,可見明顯的導(dǎo)管部與表皮細(xì)胞相連?；ū丑蛤芷つw腺可區(qū)分為黏液腺和顆粒腺2種。一般情況下顆粒腺大于黏液腺。

黏液腺:腺泡近圓形,腺細(xì)胞多呈高柱狀,H.E染色胞質(zhì)呈淡藍(lán)紫色,胞核柱狀、深染,位于細(xì)胞基底?？梢婎惣〖?xì)胞和毛細(xì)血管分布于腺泡細(xì)胞外周。在AB-PAS染色中,個別黏液腺的腺細(xì)胞可區(qū)分出玫紅色、藍(lán)色或玫紅藍(lán)相間。

顆粒腺:腺泡呈橢圓形,腺泡腔中充滿大小不一的顆粒。H.E染色中,顆粒呈粉紅色;在AB-PAS染色中,顆粒呈異質(zhì)性,較大的顆粒多呈淡紫紅色、較小顆粒多為淡藍(lán)色。個別顆粒淡染但其中可見深色的不規(guī)則核心結(jié)構(gòu)。大多數(shù)腺細(xì)胞呈扁平狀,H.E染色胞質(zhì)呈淡藍(lán)紫色,核呈圓形或橢圓形、深染,位于細(xì)胞基底部。類肌細(xì)胞及毛細(xì)血管分布于腺泡細(xì)胞外周。

由表1可見,2種腺體在背腹側(cè)皮膚中呈不均勻分布,顆粒腺主要分布于背側(cè)皮膚中,腹側(cè)皮膚顆粒腺較少。

2.2 相關(guān)物質(zhì)含量的測定

背側(cè)、腹側(cè)皮膚中相關(guān)物質(zhì)含量檢測結(jié)果見表2。在皮膚與抗氧化功能有關(guān)的3個參數(shù)中,丙二醛(MDA)的含量在背腹側(cè)皮膚中幾乎相等;背側(cè)皮膚中超氧化物歧化酶(SOD)含量是腹側(cè)皮膚的87.77%,且二者之間有極顯著性差異;而背側(cè)皮膚中過氧化氫酶(CAT)的含量卻是腹側(cè)的122.56%,二者間呈顯著性差異?；ū丑蛤鼙掣蛊つw與其免疫功能有關(guān)的2個參數(shù)中,β-防御素在背、腹側(cè)皮膚中含量基本相等;而背側(cè)皮膚中TLR4含量僅為腹側(cè)的57.62%,二者間呈極顯著性差異。

表2 花背蟾蜍背腹側(cè)皮膚抗氧化酶、βD和TLR受體含量

注:同一列不同小字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 花背蟾蜍皮膚結(jié)構(gòu)與生活環(huán)境的關(guān)系

兩棲類是脊椎動物完成從水到陸演化的一個重要環(huán)節(jié),兩棲類皮膚的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)也顯示了相應(yīng)的特征:兩棲類皮膚裸露光滑,表皮有一定程度的角質(zhì)化,可以起到防止體內(nèi)水分流失的作用[17],同時(shí)豐富的皮膚腺使兩棲類體表保持濕潤,以保證皮膚具有一定的氣體交換功能[18-19]?；ū丑蛤芷つw明顯較其他蟾蜍類薄,甚至比屬于水棲類型的黑斑側(cè)褶蛙[16]的皮膚還要薄。這個結(jié)果是否與本實(shí)驗(yàn)用花背蟾蜍均為剛完成產(chǎn)卵、還處于繁殖季節(jié)有關(guān),還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

3.2 花背蟾蜍皮膚抗氧化能力

由于臭氧層的削弱,地面承受的紫外輻射明顯增強(qiáng)。紫外線中能抵達(dá)地球表面的主要成分是長波紫外線(UVA)和中波紫外線(UVB),由于二者物理性質(zhì)的差異,對生物體的影響也具有明顯的差異。其中UVA雖然其本身能量很低,對細(xì)胞和生物大分子沒有直接的損傷效應(yīng),但其具有很強(qiáng)的穿透力,可以通過細(xì)胞所含有的內(nèi)源性發(fā)色團(tuán)的作用,誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基。氧自由基對細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸具有極強(qiáng)的氧化作用,使其產(chǎn)生丙二醛(MDA),其是細(xì)胞膜受氧化程度的標(biāo)志物之一[20-21]。同時(shí)生物體的細(xì)胞中也存在著一套抗氧化內(nèi)體系,能及時(shí)清除過多的氧自由基,以維護(hù)細(xì)胞的正常功能[10]。抗氧化酶系中的SOD在細(xì)胞中主要是清除活性氧自由基,使其形成H2O2后再由CAT進(jìn)一步還原為H2O[22-23]。因此,檢測花背蟾蜍皮膚中MDA 、SOD、CAT的含量可以反映花背蟾蜍皮膚的抗氧自由基的能力。本研究結(jié)果顯示花背蟾蜍背腹側(cè)皮膚中MDA含量基本相同,提示經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)的花背蟾蜍背腹側(cè)皮膚細(xì)胞膜脂氧化程度基本相同。但SOD和CAT卻表現(xiàn)出背腹側(cè)的明顯差異,在背側(cè)皮膚中作用于氧自由基的SOD含量低于腹側(cè),而作用于H2O2的CAT卻高于腹側(cè)。這是否是背腹側(cè)皮膚結(jié)構(gòu)的差異以及與環(huán)境接觸的方式不同等原因?qū)е赂箓?cè)皮膚抗氧化酶的活性較背側(cè)高以防止氧自由基對細(xì)胞的破壞作用還有待于深入研究。

3.3 花背蟾蜍皮膚免疫能力

皮膚對于兩棲類來說不僅僅是體表的保護(hù)層,更重要的是還承擔(dān)著部分天然免疫的功能。皮膚中腺體的分泌物在保持體表濕潤有利于氣體交換和分泌大量的皮膚抗菌肽以保護(hù)兩棲類避免微生物的侵害發(fā)揮著極其重要的作用[24]。β-防御素是抗菌肽之一,廣泛存在于生物體直接和間接與外界接觸的位置,它可以直接攻擊侵入的微生物,還有趨化活性和免疫激活的功能。而β-防御素表達(dá)目前研究比較透徹的是經(jīng)過NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行誘導(dǎo)。此通道中關(guān)鍵的蛋白是作為膜整合蛋白的病原模式識別受體,Toll樣受體(TLRs)就是其中的一類[25-26]。本研究中花背蟾蜍TLR4的含量腹側(cè)皮膚遠(yuǎn)高于背側(cè),而2個部位的βD-1含量基本相同。揭示了花背蟾蜍腹側(cè)皮膚有著很強(qiáng)的免疫應(yīng)激能力,這種應(yīng)激能力的儲備可能與其運(yùn)動方式有一定的聯(lián)系。由于蟾蜍類的肩帶是固胸型。因此,它們在運(yùn)動中常常以爬行的方式進(jìn)行,這樣就有很多機(jī)會與凸凹不平的地面接觸,從而也避免不了被微生物侵入。腹側(cè)皮膚中儲存有一定量的βD-1和可以誘導(dǎo)其表達(dá)的TLR就可以及時(shí)利用天然免疫功能防止機(jī)體的進(jìn)一步被感染。

[ 1 ]劉炯宇,江建平,謝鋒,等. 兩棲動物皮膚結(jié)構(gòu)及皮膚抗菌肽[J]. 動物學(xué)雜志, 2004,39(1):112-116.

[ 2 ]白冰,王劍. 兩棲動物皮膚幾類生物活性多肽的研究進(jìn)展[J]. 科技信息, 2011(5):115.

[ 3 ]賴仞,趙宇,楊東明,等. 六種常見兩棲類動物皮膚分泌物的生物活性比較(英文)[J]. 動物學(xué)研究, 2002,23(2):113-119.

[ 4 ]吳文英,李丕鵬,陸宇燕,等. 黑龍江林蛙繁殖期兩性皮膚組織結(jié)構(gòu)的差異比較[J]. 野生動物, 2011,32(3):141-145.

[ 5 ]崔立勇,佟慶. 東北林蛙的皮膚結(jié)構(gòu)[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2013(8):116.

[ 6 ]牛熙,徐云龍,冉雪琴,等. 務(wù)川臭蛙皮膚及指趾組織學(xué)特征[J]. 四川動物, 2012,31(5):755-759.

[ 7 ]張賢芳,張耀光,王志堅(jiān),等. 中華蟾蜍皮膚的組織學(xué)觀察[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002,24(5):454-457.

[ 8 ]王曉茹,陸宇燕,聶穎,等. UVA對花背蟾蜍微核及核異常的誘導(dǎo)[J]. 四川動物, 2010,29(3):357-362.

[ 9 ]萬麗霞,李宏偉,孫立新,等. 花背蟾蜍繁殖與食性研究[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2014,49(7):3-5.

[10]屈婷婷,李丕鵬,聶穎,等. 長波紫外線照射對花背蟾蜍腎臟結(jié)構(gòu)損傷[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2012,31(6):1480-1486.

[11]馮磊,戴昕鵬,張軍,等. 重金屬污染條件下花背蟾蜍跳躍能力與骨骼肌ATP酶和AChE活性變化研究[J]. 四川動物, 2012,31(4):553-557.

[12]仝允栩,楊增明. 花背蟾蜍蝌蚪發(fā)生類壞死的皮膚在恢復(fù)過程中的超微結(jié)構(gòu)[J]. 實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào), 1988,21(4):31-36,38,43.

[13]詹玉田,葛瑞昌,張暉. 花背蟾蜍角膜和皮膚蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào), 1990,26(4):132-134.

[14]吳文英,李丕鵬,陸宇燕. 花背蟾蜍和中華蟾蜍皮膚腺體及耳后腺體的組織學(xué)研究[J]. 蛇志, 2011,23(1):20-25.

[15]李妍,李丕鵬,崔惠生,等. 花背蟾蜍蝌蚪皮膚的結(jié)構(gòu)與發(fā)育[J]. 動物學(xué)雜志, 2013,48(4):588-596.

[16]李洋,金磊,李昌春,等. 黑斑蛙、虎紋蛙和牛蛙皮膚的比較組織學(xué)[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2009,32(5):466-470.

[17]解謙. 脊椎動物從水生到陸生的結(jié)構(gòu)演變[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2003,23(4):383-385.

[18]曹燕,謝鋒,江建平. 齒突蟾屬四個物種皮膚的組織學(xué)觀察[J]. 四川動物, 2011,30(2):214-219,321.

[19]林文達(dá),朱靜,郭愛偉,等. 云南昆明地區(qū)三種蛙皮膚顯微結(jié)構(gòu)的比較[J]. 四川動物, 2008,27(3):420-421,423,481.

[20]LIU Cunbao,HONG Jing,YANG Hailong,et al. Frog skins keep redox homeostasis by antioxidant peptides with rapidradical scavenging ability[J]. Free Radic Biol Med, 2010,48(9):1173-1181.

[21]聶穎,李丕鵬,陸宇燕,等. 長波紫外線輻射對脊椎動物的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2010,29(5):1021-1027.

[22]宋剛,張迎梅,朱麗娜,等. 黃河上游環(huán)境污染對花背蟾蜍抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響[J]. 四川動物, 2007,26(2):434-437.

[23]GUO Wentao,AO Mingzhang,LI Wei,et al. Major biological activities of the skin secretion of the Chinese giant salamander, Andrias davidianus[J]. Verlag der Zeitschrift für Naturforschung, 2012,67(1):86-92.

[24]金莉莉,王秋雨. 蛙科兩棲動物皮膚抗菌肽的分子多樣性及功能[J]. 遺傳, 2008,30(10):1241-1248.

[25]賈紅敏,盧立志,石放雄,等. 動物TLR4基因多態(tài)性及其抗病相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2010,22(6):546-550.

[26]段婷婷,李丕鵬,陸宇燕. 脊椎動物β-防御素的研究進(jìn)展[J]. 沈陽師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2014,32(2):139-143.

Microstructure of toad (Buforaddei) andits antioxidant and immune function

GAOFengjuan,LIPipeng,LUYuyan

(Institute of herpetology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

In order to understand the skin structure and function of the toad (Buforaddei), the conventional paraffin section technique and ELISA were adopted to observe the microstructural characteristics of its dorsal skin, ventral skin and skin glands; and determine the contents of SOD, CAT, MDA, TLR4 andβD-1 of the dorsal skin and ventral skin, respectively. The results show that the toad skin structures are similar to other amphibians. That is the ventral cuticle thicker than the dorsal, the dorsal epidermis and dermis thicker than the ventral, granular glands mainly in the dorsal skin, and mucous glands in the ventral skin. SOD and TLR4 examined in the ventral skin are higher than in the dorsal skin, CAT containing in the dorsal skin is higher than in the ventral skin, but MDA andβD-1 are similar in these two areas. In conclusion, the structures and related protein levels of the toad skin closely adapt to the living environment, and have the antioxidant capacities and natural immune functions.

Buforaddei; skin; structure; SOD; TLR4;βD-1

2015-04-07。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30870276)。

高鳳娟(1990-),女(蒙古族),遼寧阜蒙縣人,沈陽師范大學(xué)碩士研究生; 通信作者: 陸宇燕(1962-),女,上海人,沈陽師范大學(xué)教授,碩士研究生導(dǎo)師。

1673-5862(2015)03-0324-05

Q246; Q136; Q954.539

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2015.03.002