焦 昆，孫 琪，馬 璐，劉 鑫，李 浩，王環(huán)愿，王 雯，劉慧榮

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絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2的表達(dá)與大鼠肝功能衰老的關(guān)系

焦 昆，孫 琪，馬 璐，劉 鑫，李 浩，王環(huán)愿，王 雯，劉慧榮*

（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，北京 100069）

觀察促凋亡蛋白絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2在衰老大鼠心、腎、肝、肺和脾中的表達(dá)情況，研究大鼠肝中Omi/HtrA2的表達(dá)與肝功能衰老程度的相關(guān)性。選用3月齡、9月齡和22月齡雄性SD大鼠；多普勒超聲方法檢測(cè)動(dòng)物心功能；血清生化方法檢測(cè)動(dòng)物的肝功能；免疫組化方法比較Omi/HtrA2在心、肝、肺、腎、脾中的表達(dá)情況；Western免疫印跡方法檢測(cè)動(dòng)物肝中Omi/HtrA2表達(dá)情況。（1）在心、腎、肝和肺中，Omi/HtrA2表達(dá)量都很高，且蛋白的表達(dá)位置有一定的細(xì)胞特異性；與壯年組相比，衰老組大鼠的肝中Omi/HtrA2的表達(dá)量顯著下降（＜0.05），而在心、腎、肺組織中Omi/HtrA2的表達(dá)量也有下降的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；（2）與壯年組相比，衰老組動(dòng)物肝功能指標(biāo)：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血清鐵（SI）、白蛋白（ALB）、白蛋白與球蛋白比值（A/G）都發(fā)生顯著改變（＜0.05）；衰老組動(dòng)物的心功能指標(biāo)：左室短軸縮短率（FS）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）都有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；（3）與壯年組相比，中年組和衰老組大鼠的肝中Omi/HtrA2的表達(dá)量顯著下降（＜0.05），隨著年齡增加肝功能逐漸降低，Omi/HtrA2的表達(dá)量與ALB和A/G呈顯著正相關(guān)（＜0.05）。大鼠肝中Omi/HtrA2的表達(dá)量與肝功能呈正相關(guān)。

大鼠；衰老；Omi/HtrA2；心功能；肝功能

衰老（aging）被認(rèn)為是從細(xì)胞到組織水平損傷不斷積累，機(jī)體系統(tǒng)穩(wěn)定性降低，最終導(dǎo)致組織、器官的生理功能下降的過程[1]。與衰老有密切聯(lián)系的心腦血管疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤等疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康。因此，了解衰老的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)于人類預(yù)防疾病、提高生存質(zhì)量都具有重要意義。雖然對(duì)于衰老的研究已經(jīng)有很多，但其發(fā)生機(jī)制迄今還不十分清楚。

絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2隸屬于HtrA（High temperature requirement A，HtrA）家族，主要存在于細(xì)胞的線粒體中。在細(xì)胞中可以通過半胱氨酸蛋白酶（胱天蛋白酶，cysteine-dependent aspartate-specific proteases，caspases）家族依賴和非依賴途徑參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展[2]。但最新的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠體內(nèi)Omi/HtrA2蛋白酶活性喪失后，動(dòng)物機(jī)體會(huì)表現(xiàn)出一些衰老的特征[3]。這個(gè)實(shí)驗(yàn)提示Omi/HtrA2可能與衰老有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的是探究生理狀態(tài)下Omi/HtrA2的表達(dá)與器官衰老的可能聯(lián)系，為衰老機(jī)制的相關(guān)研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

壯年組（young）使用3月齡（＝6），中年組（middle-aged）使用9月齡SPF級(jí)SD雄性大鼠（＝5）[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]。衰老組（aged）使用22月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠（＝6）[長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012]。在大鼠肝中Omi/HtrA2表達(dá)與肝功能相關(guān)性研究部分，每組大鼠均各取5只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利委員會(huì)相關(guān)審查，倫理編號(hào)：AEEI-2014-076。

1.2 主要試劑

Omi/HtrA2兔來源一抗（美國Abcam公司，貨號(hào)ab32092）。兔超敏二步法檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋，貨號(hào)PV-9001）。β-actin小鼠來源一抗（美國Santa公司，貨號(hào)sc-47778），辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號(hào)ZB-2301），辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（均北京中杉金橋，貨號(hào)ZB-2305）。

1.3 儀器

全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi，7180），高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)（VisualSonics，Vevo-770）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 心功能檢測(cè) 按200mg/kg劑量腹腔注射5%水合氯醛誘導(dǎo)麻醉大鼠。動(dòng)物胸部備皮，仰臥位固定于動(dòng)物固定臺(tái)上，連接呼吸麻醉面罩。使用RMV-716型大鼠高頻探頭（頻率：17.5MHz）。使用高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)自帶的軟件測(cè)量指標(biāo)：左室短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）和左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.4.2 動(dòng)物安樂死及取材 按照350mg/kg劑量腹腔注射5%水合氯醛麻醉大鼠后，打開腹腔，從腹主動(dòng)脈采集適量血液，用于生化檢測(cè)。使用斷頭方法活殺動(dòng)物。迅速剪取動(dòng)物的心、肝、脾、肺、腎的部分組織，分別放入4%多聚甲醛和液氮中固定。

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色 組織在4%多聚甲醛中充分固定，常規(guī)方法制作蠟塊、切片，Omi/HtrA2一抗按1∶150稀釋，免疫組化染色步驟按照二抗試劑盒的說明書進(jìn)行。結(jié)果使用IPP6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。在相同放大倍數(shù)下，每張切片選取5個(gè)區(qū)域，取積分光密度（integrated optic density，IOD）的平均值代表該切片的蛋白表達(dá)水平。

1.4.4 肝功能檢測(cè) 使用真空采血管從動(dòng)物腹主動(dòng)脈采集全血，3000r/min，4℃離心10min，取上清。采用生化分析儀檢測(cè)肝功能指標(biāo)。

1.4.5 Western免疫印跡 常規(guī)方法提取肝組織蛋白，BCA方法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳條件：使用5%濃縮膠和12%分離膠，80V跑20min后改為120V直到溴酚藍(lán)跑出終止電泳。轉(zhuǎn)膜條件：0.22μm硝酸纖維膜，濕轉(zhuǎn)200mA，40min。Omi/HtrA2一抗?jié)舛?∶1000，二抗?jié)舛?∶2000；β-actin一抗?jié)舛?∶2000，二抗?jié)舛?∶2000?；瘜W(xué)發(fā)光方法檢測(cè)蛋白量。結(jié)果使用Image Lab5.0軟件處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Omi/HtrA2在衰老組大鼠與壯年組大鼠心、腎、肝、肺和脾中的表達(dá)

2.1.1 不同組織器官中Omi/HtrA2的表達(dá)情況 Omi/HtrA2在心廣泛表達(dá)于心肌細(xì)胞中；在腎主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞中；在肝廣泛表達(dá)于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中；在肺主要表達(dá)在平滑肌細(xì)胞中；在脾表達(dá)位置分散且表達(dá)量非常低（圖1A）。

2.1.2 衰老大鼠肝中Omi/HtrA2的表達(dá)量下降 通過對(duì)免疫組化染色結(jié)果的半定量分析可見，與壯年組大鼠相比，衰老組大鼠肝中Omi/HtrA2的表達(dá)量顯著下降（＜0.05）；在心、肺、腎、脾中蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05；圖1B）。

2.2 衰老大鼠與壯年大鼠肝和心功能比較

2.2.1 衰老大鼠與壯年大鼠肝功能比較 反映肝功能的血清生化檢測(cè)結(jié)果顯示，與壯年大鼠相比，衰老大鼠的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）、血清鐵（serum iron，SI）、血清白蛋白（serum albumin，ALB）和白蛋白與球蛋白比值（albumin/glbumin，A/G）這4項(xiàng)指標(biāo)的結(jié)果都出現(xiàn)了異常，且這些差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05；圖2）。衰老大鼠肝功能較壯年大鼠有顯著下降。

2.2.2 衰老大鼠與壯年大鼠心功能比較 在左室短軸的二維圖像引導(dǎo)下，取M型曲線，測(cè)量心功能指標(biāo)LVEF和FS。結(jié)果顯示，與壯年組相比，衰老大鼠的兩項(xiàng)心功能指標(biāo)雖均有下降的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05；圖3）。衰老大鼠心功能較壯年大鼠無明顯下降。

2.3 大鼠肝中Omi/HtrA2表達(dá)與肝功能相關(guān)性

研究顯示，衰老大鼠肝功能出現(xiàn)異常，且肝中Omi/HtrA2表達(dá)降低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與壯年組相比，中年組和衰老組大鼠肝中Omi/HtrA2表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05；圖4A）。生化檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著年齡的增加大鼠肝功能指標(biāo)ALB和A/G均下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05；圖4B）。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Omi/HtrA2的表達(dá)量與ALB呈正相關(guān)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＝0.589，＜0.05；圖4C）；Omi/HtrA2的表達(dá)量與A/G呈正相關(guān)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＝0.772，＜0.01；圖4D）。以上結(jié)果提示大鼠Omi/HtrA2的表達(dá)與肝功能之間呈正相關(guān)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下，Omi/HtrA2存在于細(xì)胞的線粒體中，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，則被釋放到胞漿中參與細(xì)胞凋亡發(fā)生[4,5]。那么Omi/HtrA2當(dāng)存在于線粒體中時(shí)，是否具有生物學(xué)效應(yīng)？研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠的非神經(jīng)系統(tǒng)的組織、器官中Omi/HtrA2失去蛋白酶活性時(shí)，小鼠出現(xiàn)被毛脫落、生殖能力下降、體質(zhì)量降低、脊柱彎曲等多種類似衰老的現(xiàn)象。而線粒體在衰老過程中具有重要意義[6]。這些實(shí)驗(yàn)都提示，在正常情況下，存在于線粒體的Omi/HtrA2同樣具有作用，這種作用可能與衰老之間存在一定的聯(lián)系。

圖1 Omi/HtrA2在壯年和衰老大鼠心、腎、肝、肺和脾中的表達(dá)

A: Immunohistochemical staining for Omi/HtrA2. Omi/HtrA2 (tan color) is expressed in all those organs of rats from two groups (Scale bar, 100μm). B: quantitative analysis for the expression level of Omi/HtrA2. Compared with 3 months group,*＜0.05

圖2 壯年大鼠和衰老大鼠的肝功能

AST: aspartate transaminase; SI: serum iron; ALB: serum albumin; A/G: albumin/globumin; A: AST; B: SI; C: ALB; D: A/G. Compared with 3months group,*＜0.05

圖3 多普勒超聲方法檢測(cè)大鼠心功能

LVEF: left ventricular ejection fraction; FS: fractional shortening of left ventricule; A: M-mode curve of Doppler ultrasonograpty. B: LVEF of rats in different groups. C: FS of rats in different groups

圖4 Omi/HtrA2與肝功能的相關(guān)性

ALB: serum albumin; A/G: albumin/glbumin. A: Western blot of liver homogenates from different groups with antibodies specific for Omi/HtrA2. Compared with 3 months group,*＜0.05. B: biochemical analysis for ALB and A/G from different groups. Compared with 3 months group,*＜0.05; compared with 9 months group,#＜0.05. C: Pearson correlation analysis for Omi/HtrA2 and ALB. D: Pearson correlation analysis for Omi/HtrA2 and A/G

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在不同器官中都有Omi/HtrA2的表達(dá)；特別是在衰老大鼠的肝中我們發(fā)現(xiàn)隨著月齡的增加Omi/HtrA2的表達(dá)顯著減低。為什么其他器官Omi/HtrA2的表達(dá)變化不顯著呢？我們認(rèn)為這種現(xiàn)象可能與22月齡大鼠的不同器官衰老程度有關(guān)。有意思的是，通過對(duì)心的超聲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，22月齡大鼠的心并未出現(xiàn)明顯衰老的現(xiàn)象，這與文獻(xiàn)[7]的研究結(jié)果一致。肝功能檢測(cè)結(jié)果提示隨著年齡的增加大鼠肝功能出現(xiàn)衰老，與文獻(xiàn)[8]的研究結(jié)果一致。運(yùn)用Pearson相關(guān)性分析方法評(píng)價(jià)大鼠肝中Omi/HtrA2的表達(dá)與其功能的相關(guān)性，結(jié)果提示Omi/HtrA2表達(dá)下降與肝功能指標(biāo)降低程度呈正相關(guān)。另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Omi/HtrA2表達(dá)下降的發(fā)生早于肝功能下降。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Omi/HtrA2可能參與了肝衰老的發(fā)生發(fā)展過程。

那么，Omi/HtrA2可能通過哪些途徑參與到肝的衰老呢？目前已知可以引起衰老的因素包括遺傳因素、氧自由基損傷、線粒體DNA（mtDNA）突變、應(yīng)激能力下降等[1,9,10]。肝作為重要的能量代謝器官，其細(xì)胞中含有豐富的線粒體。研究發(fā)現(xiàn)，Omi/HtrA2參與線粒體功能的維持，缺失Omi/HtrA2可以導(dǎo)致mtDNA突變?cè)黾覽3,11,12]。這提示，Omi/HtrA2可能通過促進(jìn)線粒體的穩(wěn)定，從而抑制肝的衰老。另外近幾年的研究發(fā)現(xiàn)自噬通過維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，對(duì)于延緩衰老也起到重要的作用[13?16]，Li等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，Omi/HtrA2可以通過抑制Hax-1的作用，從而促進(jìn)beclin-1的促自噬作用。Cilenti等[18]報(bào)道了Omi/HtrA2與線粒體泛素化連接酶激活劑NF-κB（mulan）和線粒體自噬關(guān)系。這些研究都提示，Omi/HtrA2可能通過影響自噬抑制衰老。但想要弄清Omi/HtrA2參與肝衰老的具體方式和機(jī)制，還需要今后進(jìn)一步研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)提示在生理狀態(tài)下，Omi/HtrA2表達(dá)下降可能與老年大鼠肝功能下降有關(guān)。這為今后肝衰老機(jī)制的研究提供了新的思路。

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（編輯: 周宇紅）

Relationship of serine protease Omi/HtrA2 expression with aging of liver function in rats

JIAO Kun, SUN Qi, MA Lu, LIU Xin, LI Hao, WANG Huan-Yuan, WANG Wen, LIU Hui-Rong*

(Faculty of Physiology and Pathophysiology, College of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China)

To investigate the expression of proapoptotic serine protease, Omi/HtrA2, in the heart, kidneys, liver, lungs and spleen of rats at different ages and to explore the correlation between its expression and the aging of liver function.Male SD rats at the age of 3, 9 or 22 months were employed in the study. Their heart function was evaluated by echocardiography, and liver function was tested by automatic biochemical analysis. The expression level and location of Omi/HtrA2 in the above mentioned organs were determined by immunohistochemical staining. The expression of Omi/HtrA2 in the liver was detected by Western blotting.(1) Omi/HtrA2 Was highly expressed in the heart, kidneys, liver and lungs of rats from different age groups, and mainly in certain types of cells in different organs. Compared with the young group, its expression was markedly decreased in the liver of rats from aged groups (＜0.05). But no significant difference was seen in the other organs between the young and aged groups though with a trend of descending (＞0.05). (2) There were significant differences in the liver function indices, such as the serum levels of aspartate aminotransferase (AST), serum iron (SI), albumin (ALB), and ratio of albumin to globulin (A/G) between the young and aged rats (＜0.05). The cardiac function indicators, fractional shortening (FS) and left ventricular ejection fraction (LVEF) were in a trend of decreasing in the aged rats compared with the younger though without obvious difference (＞0.05). (3) The expression level of Omi/HtrA2 was obviously reduced in the middle aged and aged rats than the young ones (＜0.05). The liver function was also descended with aging. There was a positive correlation of the expression level of Omi/HtrA2 with the level of ALB and ratio of A/G (＜0.05 ).The liver expression of Omi/HtrA2t is positively correlated with liver function in rats.

rats; aging; Omi/HtrA2; heart function; liver function

R339.3+8

A

10.11915/j.issn.1671-5403.2015.02.032

(81270283).

2014?11?04;

2015?01?05

國家自然科學(xué)基金（81270283）

劉慧榮, E-mail: liuhr2000@126.com