蔡方剛，郭平凡，詹騰輝，吳捷

（福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 血管外科，福建 福州350004）

糖尿病周圍血管病變是糖尿病的一種較為嚴重的并發(fā)癥，與其體內(nèi)的高糖等代謝紊亂有關，高糖等引起的血管內(nèi)皮細胞損傷是糖尿病血管病變的基礎[1]。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）可應用于糖尿病的治療，近年來，其對心血管疾病的作用也越來越受到人們的重視，本研究通過觀察其對兔胸主動脈內(nèi)皮細胞在高糖下增殖與凋亡變化的影響，來觀察其對糖尿病血管病變的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

新西蘭大白兔，雄性，體重約2.5～3.0 kg，購于吳氏實驗動物中心，GLP-1、GLP-1受體拮抗劑（exendin9-39）、Ⅰ型膠原酶、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma公司），BRDU增殖試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒（Roche公司），M199細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰酶-EDTA（Life公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 兔胸主動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

無菌條件下取兔胸主動脈約5 cm，PBS沖洗2、3次；向血管內(nèi)注入約1～2ml 0.1% I型膠原酶，37℃15～20min，用M199培養(yǎng)液沖洗3、4次，300 g離心10min；棄上清，加入含20%FBS的M199培養(yǎng)基，置37℃5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱24 h，更換培養(yǎng)基；鏡下觀察，待細胞長至70%～80%匯合時行1∶2傳代，取3～5代細胞進行實驗。實驗分為4組，分別為對照組（正常糖濃度）、高糖組（33mM）、GLP-1組（GLP-1+高糖）、exendin9-39組（GLP-1+exendin9-39+高糖）。其中，GLP-1組為GLP-1（10-8M）預處理內(nèi)皮細胞60min后，再給予高糖（33mM）干預24 h。exendin9-39組為exendin9-39（10-7M）預處理30 min后加GLP-1（10-8M）60min再給予高糖（33mM）干預24 h。各組進行各項指標的檢測。

1.3 TUNEL法測定胸主動脈內(nèi)皮細胞凋亡

取3～5代兔胸主動脈內(nèi)皮細胞消化接種于預先放置有蓋玻片6孔培養(yǎng)板中，105細胞/孔，觀察待細胞生長至約60%～70%匯合時更換0.2% FBS的M199培養(yǎng)基24 h，加入33mM葡萄糖及其他試劑干預，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，4%甲醛固定液15min，棄固定液，PBS漂洗5min×3，加0.1%Triton于25℃條件10min，加5μg/ml蛋白酶K37℃20min，PBS漂洗5min×3，加TUNEL反應液50μl/片，37℃60min，PBS漂洗5min×3，加converter-POD混合液50μl/片，37℃ 30 min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片。

1.4 BRDU法測定胸主動脈內(nèi)皮細胞增殖

取3～5代兔胸主動脈內(nèi)皮細胞消化接種96孔培養(yǎng)板，2×103細胞/孔，觀察待細胞生長至約60%～70%匯合時更換0.2%FBS的M199培養(yǎng)基24 h，加入33mM葡萄糖及其他試劑干預，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，4%甲醛固定液15 min，棄固定液，PBS漂洗5 min×3，加HRP-Anti-BRDU抗體（1∶100）于25℃條件2 h，PBS漂洗5m in×3，加BRDU試劑盒中D反應液100μl/孔，37℃10～20 min，加25μl/孔1M H2SO4終止，酶標儀450 nm檢測，以OD值大小表示細胞增殖水平。

1.5 MTT法測定胸主動脈內(nèi)皮細胞代謝與增殖活性

取3～5代兔胸主動脈內(nèi)皮細胞消化接種96孔培養(yǎng)板，2×103細胞/孔，觀察待細胞生長至約60%～70%匯合時更換0.2% FBS的M199培養(yǎng)基24 h，加入33mM葡萄糖及其他試劑干預，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加10×MTT 10μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加100μl DMSO，小心振蕩1～2min，酶標儀450 nm波長檢測，以OD值大小表示細胞代謝增殖活性水平。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 GLP-1對高糖誘導內(nèi)皮細胞凋亡的影響

對照組兔內(nèi)皮細胞形態(tài)規(guī)則，多呈卵圓狀，只見少量細胞核呈棕黃色；高糖組內(nèi)皮細胞形態(tài)呈多形性，并有大量內(nèi)皮細胞細胞核呈棕黃色；GLP-1組呈星形，卵圓狀只見少量棕黃色細胞細胞核；exendin9-39組內(nèi)皮細胞形態(tài)多呈卵圓，可見大量量細胞核有棕黃色顆粒（見圖1D）。每張切片在高倍視野下（×200）取5個視野，計數(shù)5個視野中每100個細胞中染色陽性的細胞數(shù)（%），取其平均數(shù)作為各組凋亡率。與對照組相比，高糖組細胞凋亡明顯增加（P<0.01）；與高糖組相比，GLP-1組可顯著降低高糖誘導細胞凋亡（P<0.05），而exendin9-39組細胞凋亡率與高糖組差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 各組兔胸主動脈內(nèi)皮細胞凋亡的變化

2.2 BRDU法測GLP-1對高糖下內(nèi)皮細胞增殖的影響

高糖明顯地抑制內(nèi)皮細胞增殖活性，與對照組相比，高糖組內(nèi)皮細胞增殖水平顯著降低（P<0.01）。與高糖組相比，GLP-1組內(nèi)皮細胞增殖水平顯著升高；exendin9-39組內(nèi)皮細胞增殖水平與高糖組相比無明顯差別（P>0.05）。見圖2。

2.3 MTT法檢測GLP-1對高糖誘導內(nèi)皮細胞代謝的影響

高糖抑制內(nèi)皮細胞代謝活性，與對照組相比，高糖組內(nèi)皮細胞代謝水平顯著降低（P<0.01）。與高糖組相比，GLP-1組內(nèi)皮細胞代謝活性顯著升高（P<0.05），而exendin9-39組內(nèi)皮細胞代謝活性與高糖組相比無明顯差別（P>0.05）。見圖3。

圖2 各組內(nèi)皮細胞增殖的變化

圖3 各組MTT值的變化

3 討論

糖尿病所引起的高血糖、脂代謝紊亂、胰島素拮抗等因素引起的內(nèi)皮細胞損傷是糖尿病血管病變的始動環(huán)節(jié)。研究表明持續(xù)性的高血糖可引起內(nèi)皮細胞缺失、血管收縮、局部組織缺血缺氧、血管平滑肌細胞增生，從而導致糖尿病血管病變的發(fā)生[2]。從本實驗可以看出，高糖可以導致血管內(nèi)皮細胞的凋亡增多，而增殖減少，細胞的活性下降。高糖引起的內(nèi)皮細胞損傷與其引起胞內(nèi)的氧自由基產(chǎn)物生成增多密切相關[3]。

GLP-1是一種腸道分泌的肽類激素，有促進胰島素合成與分泌，以及增加β 細胞的增殖分化與抑制其凋亡的作用，在維持機體糖代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)，它對心血管也有保護作用。HALBIRK等[4]發(fā)現(xiàn)，GLP-1可以改善心力衰竭動物及急性心肌梗死患者的射血分數(shù)和左心室功能。它具有提高心肌正性肌力，促進心肌攝取葡萄糖，抑制心肌細胞凋亡，降低缺血/再灌注損傷的作用。而ERDOGDU等[5]發(fā)現(xiàn)，GLP-1類似物可以促進心臟的冠狀動脈的內(nèi)皮細胞增殖。但它對糖尿病外周血管的病變是否有保護作用，尚未有進一步的研究。本研究通過分離兔胸主動脈的內(nèi)皮細胞進行原代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，GLP-1可以明顯地減少高糖引起的血管內(nèi)皮細胞凋亡，并改善高糖對血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用，而加入GLP-1的受體拮抗劑，此作用明顯減輕。這說明GLP-1對高糖引起的血管內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用，而這作用是由其受體介導的。

GLP-1具體的作用機制還不甚明了。雖然GLP-1受體是一種G蛋白耦聯(lián)受體，在體內(nèi)包括心臟、血管、神經(jīng)等組織均有存在。但現(xiàn)階段的研究認為，GLP-1的作用有依賴與不依賴GLP-1受體途徑兩種方式，GLP-1促進血管內(nèi)皮依賴性擴張與其經(jīng)非受體方式有關[6]。一些離體的細胞培養(yǎng)實驗表明，單純的GLP-1受體激動劑對血管內(nèi)皮細胞的缺血再灌注損傷等并沒有保護作用，存在著另一種非受體介導方式[7]。但GLP-1通過其受體介導，抑制PKC-α 和NADPH 等信號轉(zhuǎn)導通路，減少了TNF-α 引起的內(nèi)皮細胞損傷[8]。本實驗表明GLP-1對高糖引起的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用與其受體介導有關。當GLP-1與內(nèi)皮細胞表面的GLP-1受體結(jié)合后，影響了細胞內(nèi)的PKA和PI3K/Akt等信號傳導通路，可導致細胞的增殖與凋亡發(fā)生變化[9-10]。

本實驗只是作為研究GLP-1對糖尿病血管病變作用的基礎，具體的GLP-1作用機制，包括GLP-1受體在此間的作用方式等還有待進一步的研究闡明。

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[9]ERDOGDU O,NATHANSON D,SJOHOLM A,et al.Exendin-4 stimulates proliferation of human coronary artery endothelial cells through eNOS-PKA and PI3K/Akt-dependent pathways and requires GLP-1 receptor[J].Mol Cell Endocrinol,2010,325(1-2):26-35.

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