李靜

(臨沂市蘭山區(qū)畜牧獸醫(yī)局 山東 臨沂276000)

診斷目前解決禽霍亂耐藥問題的方法主要有：通過藥敏試驗選出敏感藥物，制定合適的劑量、合理的療程，選用幾種敏感藥物交替使用；采用中草藥及其方劑、中西復方藥進行防治。我市常見禽霍亂防治中的藥物和疫苗的選用提供依據(jù)。不但可提高雞的成活率，而且能減少獸藥殘留和耐藥菌株的產(chǎn)生，大大提高我市雞養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益、生態(tài)效益和社會效益。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器生化培養(yǎng)箱（型號:420型）、超靜工作臺（型號SW-CJ-ICU型）、高壓滅菌器（型號：PXQGD2型）、顯微鏡、冰箱、離心機、常用玻璃器械、牛津杯、陶皿蓋、鑷子。

1.1.2 試驗動物

1.1.2.1一周齡健康小白鼠12只(大小、體重相近,雌雄各半)。

1.1.2.230周齡健康蛋雞20羽。

1.1.2.3來自臨沂市不同地方的六起自然發(fā)病病例，通過發(fā)病情況調(diào)查、臨床癥狀、病例變化、細菌學檢查、生化試驗、動物試驗確診病例為禽霍亂，共計羅曼蛋雞10000羽，海蘭蛋雞7000羽。

1.1.3 試驗用品

1.1.3.1培養(yǎng)基鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基（由試驗室提供材料按配方自制）。

1.1.3.2生化微量反應管

乳酸、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、尿素管等一系列反應生化微量反應管共11種（由試驗室提供）。購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3.3常規(guī)藥敏試紙

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、丁胺卡納、強力霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、卡那霉素等一系列常規(guī)藥敏試紙共12種(購于中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所)

1.2.試驗方法

1.2.1 病例來源臨沂市郯城、費縣、蘭山、臨沭、沂南5個縣區(qū)的6起自然發(fā)病病例，根據(jù)發(fā)病先后分別記為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。

1.2.2 發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化

調(diào)查發(fā)病情況、現(xiàn)場察看臨床癥狀、系統(tǒng)剖檢病死雞并觀察病理變化。

1.2.3 細菌學檢查

病料直接涂片染色鏡檢：采取典型病例心血、肝、脾組織病料涂片、觸片，分別經(jīng)革蘭氏染色和瑞士染色、鏡檢，取上述病料分別接種于鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基，置37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h，進行細菌分離培養(yǎng)，取分離菌進行生化試驗。

病原菌分離培養(yǎng)：取上述病料分別接種于鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基，置37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h，進行細菌分離培養(yǎng)。

1.2.4 生化試驗

分離菌純培養(yǎng)物分別接種于微量生化反應管，置37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察。

1.2.5 分離菌致病性試驗

小白鼠致病試驗：試驗分三組，每組4只。

試驗一組接種組織病料懸液：無菌操作取自發(fā)病雞肝、脾組織加滅菌生理鹽水，制成1∶10懸液，低速離心取上清液腹腔接種0.2ml/只。

試驗二組接種培養(yǎng)物：取24h肉湯培養(yǎng)物0.2ml，或鉤取鮮血瓊脂上的菌落制成生理鹽水懸液，取0.2ml，腹腔接種。

試驗三組接種生理鹽水：取0.2ml滅菌生理鹽水腹腔接種，作為對照組。

1.2.6 動物回歸試驗

若上述試驗第二組小白鼠死亡，則無菌操作取試驗死亡小白鼠病料接種于肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18h，分別取肉湯培養(yǎng)物和滅菌生理鹽水按0.1mL/只靜脈注射30周齡健康雞，試驗組雞10羽，對照組雞10羽，觀察結(jié)果。

1.2.7 藥敏試驗

1.2.7.1常規(guī)紙片法藥敏試驗：在超凈工作臺上，采用紙片擴散法。用吸管滴加純培養(yǎng)菌液1滴（約0.02ml）于鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上，涂均勻加蓋后放置10min左右，平板面稍干后，用鑷子將藥敏紙片平放在鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上，并輕壓使其緊貼平板表面，兩紙片中心距離不少于24mm，紙片與平皿邊緣不少于15mm。貼好紙片的平板，置37℃培養(yǎng)24h，測量抑菌圈，依據(jù)藥敏標準判定選出高敏藥物。

1.2.7.2判定標準：抑菌圈在0～10mm為低敏，10～15mm為中敏，15mm以上為高敏。

2 試驗結(jié)果

2.1 發(fā)病情況

根據(jù)發(fā)病先后分別記為病例Ⅰ～Ⅵ。各組的發(fā)病情況見表1。

表1 各組禽霍亂病例的發(fā)病情況

2.2 臨床癥狀

部分病雞沒有任何臨床癥狀表現(xiàn)就突然死亡，特別是白天未見異常表現(xiàn)，但于夜間死亡。大部分病雞精神沉郁，食欲減退或絕食，飲水增加。垂頭縮頸，兩翅下垂，羽毛松亂，嚴重時呼吸困難，死前張口呼吸。

2.3 剖檢變化

有的未見內(nèi)臟病理變化，僅見嗉囊中積有較多的飼料或液體；多數(shù)病例可見：皮下、腹部脂肪有出血點；心包內(nèi)有不透明黃色膠凍樣滲出物；腸粘膜和腸漿膜有出血點，尤其是十二指腸最明顯；肺瘀血和出血；腎脾充血、腫大；肝腫大、質(zhì)地變脆、呈黃色、表面布滿多量的針尖或粟粒大小的黃白色或灰白色壞死灶，縱面切開，壞死灶內(nèi)大外小，成掃把狀；產(chǎn)蛋雞卵黃膜呈紫紅色，血管怒張，有的卵黃破裂形成卵黃性腹膜炎，有的子宮中有一成熟的軟殼蛋或在泄殖腔中有一硬殼蛋。

2.4 細菌學檢查

2.4.1 涂片鏡檢

瑞士染色可見典型的兩級著色，即菌體兩端染色深，中間淺，無鞭毛，不形成芽孢，新分離的強毒菌株有莢膜；革蘭氏染色為陰性。

2.4.2 細菌分離培養(yǎng)

在鮮血瓊脂上可見到2～3mm大小的光滑、隆起、灰白色、半透明、露珠樣不溶血的小菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上未見到細菌生長；在肉湯培養(yǎng)基中出現(xiàn)輕度混濁、管底有沉淀、表面有灰白色菌環(huán)。

2.4.3 生化試驗

分離菌不液化明膠；能分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇和半乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵乳糖、肌醇和鼠李糖等；觸酶、硫化氫、M－R（甲基紅試驗）、V－P試驗均為陰性。

2.4.4 分離菌毒力試驗

試驗組一：小白鼠幾天后全部死亡，剖檢死亡鼠, 肝臟表面有許多針尖大小的壞死灶，心冠脂肪、心外膜、十二指腸等有很多出血點。試驗組二：小白鼠幾天后全部死亡，剖檢死亡鼠,肝臟表面有許多針尖大小的壞死灶，心冠脂肪、心外膜、十二指腸等有很多出血點。試驗組三：小白鼠全部正常。從病死鼠體內(nèi)能分離到與攻毒菌一樣的巴氏桿菌。

2.4.5 動物回歸試驗

試驗組10羽雞都呈現(xiàn)禽霍亂癥狀，4羽死亡，剖檢顯示為禽霍亂病理變化；對照組10羽雞完全正常。從病死雞體內(nèi)能分離到與攻毒菌一樣的巴氏桿菌。

2.5 藥敏試驗

2.5.1 西藥藥敏試驗

表3 禽霍亂西藥藥敏試驗結(jié)果

由表3可知病例Ⅰ至病例Ⅵ的首選高敏藥物依次為：氟苯尼考、恩諾沙星、諾氟沙星、丁胺卡納、環(huán)丙沙星、強力霉素。

3 討論與分析

3.1 禽霍亂是蛋雞群的常發(fā)病，及時、快速診斷病情是控制本病的重要前提，本文探討的綜合性診斷能及時準確的對病例進行診斷，具有一定的推廣價值。

3.2 防治本病的重要手段是使用抗菌西藥，但隨著抗菌西藥的廣泛使用，耐藥情況越來越嚴重，有必要通過藥敏試驗篩選有效藥物用于臨床。本藥敏試驗表明在我市流行的禽霍亂對氟苯尼考、恩諾沙星、諾氟沙星、丁胺卡納、環(huán)丙沙星、強力霉素較敏感，為臨沂市對本病進行藥物預防提供了用藥參考資料。

3.3 多殺性巴氏桿菌是體內(nèi)常在菌，當機體抵抗力下降時易發(fā)病，故要加強飼養(yǎng)管理，減少發(fā)病機會。特別要搞好衛(wèi)生消毒和免疫接種工作、及時進行藥物預防、減少應激，夏季要特別防止熱應激。

[1]楊慧芳主編.養(yǎng)禽與禽病防治[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006,1:304～307.

[2]張秀美主編.禽病防治完全手冊[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005,1:166～173.