熊 川, 李小林, 李 強, 楊志榮, 鄭林用

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所 四川 成都 610066;2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川 成都 610065)

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一株采自四川南充的羊肚菌生境調(diào)查與鑒定

熊 川2, 李小林1, 李 強1, 楊志榮2, 鄭林用1

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所 四川 成都 610066;2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川 成都 610065)

為調(diào)查四川南充羊肚菌資源并考察其發(fā)生地環(huán)境，于2014年3月31日在南充市西充縣金泉鄉(xiāng)雙橋子村采集到1株羊肚菌.通過菌絲體培養(yǎng)，鏡檢觀察完成形態(tài)鑒定，基于ITS、LSU、ef1-α、rpb1和rpb2序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹完成分子鑒定,確定為Morchellasp. (Mes-16)，歸入黃色羊肚菌支系(Esculenta Clade)，進一步結(jié)合樣地環(huán)境及土壤理化性質(zhì)分析了羊肚菌在當(dāng)季發(fā)生的可能的機制.

形態(tài)鑒定; 分子鑒定; 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

羊肚菌Morchella俗稱羊肚子、羊肚菜、陽雀菌、包谷菌，隸屬子囊菌亞門Ascomycota、盤菌綱Discomycetes、盤菌目Pezizales、羊肚菌科Morchellaceae、羊肚菌屬Morchella，因其菌蓋有不規(guī)則的凹陷且多有褶皺，外形似羊肚而得名[1].作為享譽世界的美味食用菌和藥用菌，位居世界四大野生名菌之首，是目前價格最為昂貴的野生菌之一.

真菌物種的形態(tài)特征有限且具有可塑性，僅依靠傳統(tǒng)的外部形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及生理生化指標(biāo)等特征，很難準(zhǔn)確把握真菌的系統(tǒng)親緣關(guān)系，進而對真菌進行定位.伴隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，通過基因分子手段來鑒定大型真菌的方法日臻完善.近年來，DNA序列分析已經(jīng)被真菌研究人員廣泛應(yīng)用于真菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，目前，真菌DNA研究多集中在rDNA上，其中基因間隔序列(ITS序列)已用于許多真菌的屬內(nèi)種間或種內(nèi)群體的系統(tǒng)學(xué)研究.最初，依據(jù)ITS序列的長度可以將羊肚菌分為黑羊肚菌系(black morles)和黃羊肚菌系(yellow morles)[2].進一步的研究將羊肚菌分為黃色羊肚菌支系(Esculenta Clade)、黑色羊肚菌支系(Elata Clade)和變紅羊肚菌支系(Rufobrunnea Clade)等3個支系.之后，運用ITS序列已詳細分類鑒定了北美的羊肚菌[3].

隨著羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的深入，僅僅依靠ITS序列已不能準(zhǔn)確鑒定羊肚菌種屬關(guān)系.多基因系譜一致性系統(tǒng)發(fā)育種識別法(GCPSR)作為一種更完備的方法在近年來被廣泛應(yīng)用[4].在中國，已有學(xué)者基于多基因系譜一致性系統(tǒng)發(fā)育種識別法(GCPSR)，選取ITS、LSU、ef1-α、rpb1和rpb2共5個基因標(biāo)記分析了中國大部分地區(qū)羊肚菌種屬分類與起源[5].

1 材料與方法

1.1 材料

羊肚菌子實體于2014年3月31日采集于四川省南充市西充縣金泉鄉(xiāng)雙橋子村.采樣地位于東經(jīng)105°54′11.28″，北緯31°35′28.54″，海拔361m，共采集羊肚菌1株，憑證標(biāo)本存放于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物標(biāo)本保藏中心(保藏號：Cyl170).

采用組織分離法獲得羊肚菌菌絲體.將采集到的新鮮子實體表面用濃度為0.1%的升汞消毒，挑取菌柄頂端內(nèi)部組織，將分離到的組織接種在已經(jīng)準(zhǔn)備好的改良PDA培養(yǎng)基(每升PDA培養(yǎng)基中添加2 g蛋白胨)的試管斜面上.在28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長滿后備用.實驗最終成功分離到羊肚菌菌絲體7份，菌株編號分別為NC1-7.

1.2 生境調(diào)查

1.2.1 土樣采集及理化性質(zhì)測定 在處樣地分別選定5處樣點，除去地表枯枝落葉層，采集土樣，深度20 cm，混勻用于理化性質(zhì)測定[6].參照鮑士旦《土壤農(nóng)化分析》第3版(2000)的方法[7]，對土壤氮磷鉀和有機質(zhì)進行測定.速效磷——鉬銻抗比色法；速效鉀——火焰光度法；速效氮——CaCl2浸提流動注射分析儀法；有機質(zhì)——重鉻酸鉀容量法(稀釋熱法)[8].

1.2.2 植被生境 采用GPS定位法獲取羊肚菌分布區(qū)準(zhǔn)確地理坐標(biāo)并拍攝照片.詳細調(diào)查區(qū)域植物種類組成、郁閉度，地貌類型、海拔、坡度、坡向、坡位等生境因子，逐項填記在相應(yīng)調(diào)查表內(nèi)[9].

1.3 形態(tài)觀察

第二，在歷史人物形象和性格塑造上，民間口承敘事可以拋開正史中片面、單一的刻板記錄，從多側(cè)面豐富人物性格和人物形象，使歷史人物更為飽滿真實。以努爾哈赤的傳說為例，在遼寧滿族民間口承敘事中，將收錄到的罕王傳說按講述內(nèi)容的縱向時間羅列，可以清晰地勾畫出努爾哈赤從出生、童年、歷練，一直到成為一代帝王、建功立業(yè)的生命周期和“英雄式”敘事程式。

1.3.1 子實體觀察 將采集到的子實體用無菌水輕輕沖洗兩遍，去除泥土灰塵.觀察菌蓋、菌柄的顏色，脊脈的特征，凹陷的形狀，菌蓋與菌柄的著生情況.同時測量菌蓋、菌柄的大小[10].

1.3.2 菌絲體觀察 將組織分離獲得的菌絲體試管斜面接種到新的平板上，觀察菌絲體生長情況.挑取不同時期生長狀態(tài)較好的羊肚菌的菌絲，采用壓片法制片，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體顯微形態(tài).

1.4 菌絲體分子鑒定

1.4.1 菌絲體DNA的提取 采用OMEGA公司的D3390-02 E. Z. N. A. TM Fungal DNA Kit(200)試劑盒提取菌絲體DNA.提取的DNA通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.4.2 序列擴增及檢測 5個標(biāo)記基因的序列擴增引物見表1.PCR采用50 μL體系，其中2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10μmol·L-1的引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補齊至50 μL.ITS序列PCR反應(yīng)程序為：94 ℃變性4 min，94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，完成35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min.LSU、ef1-α、rpb1和rpb2的PCR反應(yīng)程序為：94 ℃初始變性3 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，完成35個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min.PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶送Invitrogen公司(中國，廣州)測序.

1.4.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 相關(guān)序列從MorchellaMLST(Multilocus Sequence Typing.http://www.cbs.knaw.nl/morchella/)[11]下載.輔助運用GenBank的BLAST，采用MEGA 5.0軟件計算并作圖.采用Neighbor-joining聚類分析方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Maximum-parsimony法構(gòu)建聯(lián)合矩陣系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行分析[12].

2 結(jié)果與分析

2.1 樣地環(huán)境概述

2.1.1 植被情況概述 樣地為疏林地，郁閉度較低為0.2，坡向東偏南12°.高大喬木為柏樹(Cupressusfunebris)和杜梨(Pyrussp.)，地表有苔蘚Bryophyta覆蓋，其上長有腎蕨Nephrolepissp.，扁竹根Irisjaponica，苔蘚和草本植物的生長有效阻擋了陽光的直射，同時使得小區(qū)域內(nèi)濕度較大.

2.1.2 土壤理化性質(zhì)分析 樣地的pH為6.76，中偏酸性，適于羊肚菌的發(fā)生.樣地土壤為沙棕壤，保水性較差，約有0.6 cm的褐色腐殖質(zhì)層，土壤有機質(zhì)含量8.78%，全氮含量0.29%，全磷含量0.16%，全鉀含量2.43%，每千克土壤中堿解氮含量316 mg，有效磷含量28.7 mg，速效鉀含量376 mg.

表1 PCR和測序引物

2.2 形態(tài)描述

2.2.1 子實體形態(tài) 西充羊肚菌子實體小，菌蓋近似長卵圓形，長2.7 cm，寬1.8 cm(圖1A).表面多凹坑，凹坑長圓形，棕黃色至褐色，棱紋窄，不規(guī)則.菌柄近白色，短且較細，長2.4 cm，粗0.7 cm，圓柱狀，表面光滑，基部未見膨大.

2.2.2 顯微結(jié)構(gòu) 西充羊肚菌子囊孢子橢球狀(圖1B)，長徑最小12.5 μm，最大16.9 μm，平均14.3 μm，短徑最小7.9 μm，最大10.6 μm，平均8.4 μm.匍匐菌絲分枝狀(圖1C)，直徑最小6.8 μm，最大11.0 μm，平均7.9 μm.氣生菌絲竹節(jié)狀(圖1D)，內(nèi)部有大量球狀體，直徑最小9.2 μm，最大14.3 μm，平均11.7 μm.

A-D為西充羊肚菌、子囊孢子、匍匐菌絲、氣生菌絲.

經(jīng)形態(tài)觀察，可以初步確定西充羊肚菌是黃色羊肚菌支系的一種，可能為羊肚菌Morchellaesculenta(L.) Pers.或者小羊肚菌MorchelladeliciosaFr..

2.3 聯(lián)合矩陣分析

采用ITS，LSU，ef1-α、rpb1和rpb2序列聯(lián)合矩陣分析.羊肚菌被清晰的分成3個類群.變紅羊肚菌Morchellarufobrunnea作為羊肚菌的基部支系，歸入變紅羊肚菌支系.其余則分為黃色羊肚菌支系和黑色羊肚菌支系，分別對應(yīng)于傳統(tǒng)分類中的黃色系和黑色系.

圖2 基于ITS-LSU-ef1-α-rpb1-rpb2序列聯(lián)合矩陣的羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

3.1 羊肚菌的分子鑒定

從形態(tài)學(xué)上看，試驗樣品更接近于羊肚菌Morchellaesculenta(L.) Pers.或者小羊肚菌MorchelladeliciosaFr.，但是聯(lián)合矩陣將其鑒定為Mes-16.前人基于形態(tài)鑒定和ITS序列分析給出了羊肚菌的分類，但僅僅依靠ITS序列無法鑒定出羊肚菌所有的種，還出現(xiàn)了同物異名、異物同名的情況[16]，采用多基因系譜一致性系統(tǒng)發(fā)育種識別法(GCPSR)可有效鑒定，通過多個基因的DNA 核苷酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，比較其拓撲學(xué)關(guān)系，完成物種界定.在同一屬內(nèi)的物種間，同一物種的不同基因的系統(tǒng)發(fā)育拓撲結(jié)構(gòu)應(yīng)是一致的，而在同一種內(nèi)不同個體間因為發(fā)生基因重組，不同基因的系統(tǒng)發(fā)育拓撲結(jié)構(gòu)則可能會發(fā)生沖突[17].該方法為羊肚菌的分類研究提供了新的思路，并且有了成功的應(yīng)用.但目前尚無法確定依據(jù)ITS序列命名的樣本在聯(lián)合矩陣系統(tǒng)樹中具體所在的系統(tǒng)位置，也無法核對前人所命名的名稱是否在分子系統(tǒng)學(xué)研究中是一個自然類群.新舊命名系統(tǒng)中的對應(yīng)問題有待研究.

3.2 羊肚菌發(fā)生機制探討

羊肚菌大多在春季發(fā)生，少數(shù)也存在秋季出菇的現(xiàn)象.已有的報道顯示[1]，Mes-16在中國是少見的秋季出菇的品種，出菇需要一個越夏的高溫刺激.本實驗樣品為春季采集，說明羊肚菌的萌發(fā)完成了一個越冬的低溫刺激.同一種羊肚菌在不同的環(huán)境下春秋兩季都有可能萌發(fā)，這拓寬了羊肚菌有利刺激的范圍，在生活史周期中，需要一個極端溫度的刺激，高溫和低溫都可以達到促進萌發(fā)的效果.

3.3 羊肚菌的營養(yǎng)類型

通過對采樣地環(huán)境的觀察，未發(fā)現(xiàn)羊肚菌的發(fā)生與周圍的植物有明顯的關(guān)系.關(guān)于羊肚菌是腐生營養(yǎng)型還是共生營養(yǎng)型的爭論由來已久.目前已有的成功栽培實例一部分涉及到與高大喬木的伴生，諸如在廢棄的蘋果園中栽培，與圓葉楊、榆樹共生等[18].很早就有學(xué)者提出羊肚菌的生活史周期中，既有腐生階段，又有菌根真菌生長的階段[19].并且菌根階段出現(xiàn)在春季菌核萌發(fā)長出菌絲后，隨著菌絲的生長，其會與某些特殊的樹木形成共生關(guān)系.一些學(xué)者又觀察到另外的現(xiàn)象，即菌核發(fā)育到一定的階段，需要切斷其與宿主的聯(lián)系，這樣利于子囊果的發(fā)生[20].李青連等[21]基于穩(wěn)定同位素的分析方法對羊肚菌的營養(yǎng)方式進行了研究，最后得出結(jié)論菌蓋呈黑色、有縱脈的羊肚菌為腐生營養(yǎng)型，菌蓋呈污黃色的羊肚菌為菌根營養(yǎng)型.目前人工栽培成功的也大都是黑色系羊肚菌[22]，可能是腐生營養(yǎng)型更容易實現(xiàn)人工干預(yù).但本實驗樣品為黃色系，未能觀察到共生關(guān)系，可能是羊肚菌是一種階段性的共生，子囊果出現(xiàn)后，不再顯示共生關(guān)系.

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(責(zé)任編輯:吳顯達)

Habitat investigation and identification of a morel strain from Nanchong, Sichuan

XIONG Chuan2, LI Xiao-lin1, LI Qiang1, YANG Zhi-rong2, ZHENG Lin-yong1

(1.Soil and Fertilizer Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu, Sichuan 610066, China;2.School of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu, Sichuan 610065, China)

In order to investigate the resource and habitat of morel in Nanchong, Sichuan, 1 strain of morel was collected from Shuangqiaozi Village, Nanchong, Sichuan, China, in March 2014. According to morphological evidence and DNA sequences of ITS, LSU,ef1-α,rpb1 andrpb2 sequences, all samples were characterized asMorchellasp. (Mes-16), belonging to Esculenta Clade. Further analysis of the environment of morels habitat and the local soil sample indicated the possible mechanism for this autumn occurrence of morels.

morphological identification; molecular identification; phylogenetic relationship

2014-08-17

2014-09-28

四川省科技支撐計劃項目(2013NZ0029、2012NZ0003、2014FZ0004)；四川省財政創(chuàng)新能力提升工程青年基金項(2014CXSF-030).

熊川(1990-)，男，碩士.研究方向：珍稀食(藥)用菌栽培.Email:xiongchuan1234@126.com.通訊作者鄭林用(1965-)，男，研究員.研究方向：珍稀食(藥)用菌栽培.Email:zly6559@126.com.

Q939.5

A

1671-5470(2015)04-0414-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.04.014