劉萍花, 方敦煌, 吳祖建

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福建 福州 350002；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 653100)

?

應(yīng)用多重PCR檢測(cè)煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌及立枯病菌

劉萍花1, 方敦煌2, 吳祖建1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福建 福州 350002；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 653100)

通過(guò)篩選特異性引物，優(yōu)化多重PCR體系中的Mg2+、dNTP Mixture、TaqDNA聚合酶濃度，退火溫度等反應(yīng)條件，建立了多重PCR同時(shí)檢測(cè)4種病菌(煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌)的技術(shù)體系，得到265、364、400和541 bp共4條特異性條帶，對(duì)應(yīng)的病菌分別為猝倒病菌、黑脛病菌、根黑腐病菌、立枯病菌.該檢測(cè)體系的靈敏度可達(dá)10-2ng·μL-1基因組DNA.

煙草; 煙草黑脛病菌; 根黑腐病菌; 猝倒病菌; 立枯病菌; 多重PCR

煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，隨著該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，煙草病害危害逐年加重.其中，煙草黑脛病、根黑腐病、猝倒病和立枯病等是煙草上最主要的土傳病害，這些病菌相互作用，復(fù)合侵染，加劇了對(duì)煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量的影響[1].對(duì)于煙草病菌的檢測(cè)，傳統(tǒng)方法主要采用對(duì)典型癥狀的病樣進(jìn)行分離、鑒定，其耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度低，易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾[2].因此，煙草生產(chǎn)上迫切需要一種能在發(fā)病初期或土壤中進(jìn)行快速診斷的技術(shù).

多重PCR(polymerase chain reaction)是在普通PCR基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，在一個(gè)PCR 反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，針對(duì)多個(gè)DNA 模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的技術(shù)[3]，已應(yīng)用于基因診斷和病原微生物的診斷和鑒定.謝燕婷等[4]建立了豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型與豬細(xì)小病毒的多重PCR檢測(cè)體系；鄭軒等[5]應(yīng)用多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)5種煙草病毒病的檢測(cè)；張麗芳等[6]應(yīng)用多重PCR技術(shù)建立了煙草青枯病、黑脛病及猝倒病3種病菌的同步檢測(cè).但有關(guān)煙草黑脛病、根黑腐病、猝倒病和立枯病等病菌的多重PCR檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道.為此，本研究通過(guò)篩選合適的引物，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系的條件參數(shù)，建立一套同時(shí)檢測(cè)煙草黑脛病菌(hytophthoranicotianae)、根黑腐病菌(Thielavioisbasicola)、猝倒病菌(Pythiumphanidermatum)和立枯病菌(Rhizoctoniasolani)的多重PCR反應(yīng)體系，為煙草病菌的監(jiān)測(cè)、病害的診斷和防控提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試的煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌菌株均由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)室分離保存.

1.1.2 病株樣本 采集云南省玉溪市植煙區(qū)病株疑似樣本20份.

1.2 菌絲體的收集及基因組DNA的提取

將供試煙草黑脛病菌和猝倒病菌的菌株移至OA固體培養(yǎng)基平板上，根黑腐病菌和立枯病菌的菌株移至PDA平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d后在菌落邊緣切取小菌落塊，然后將根黑腐病菌和立枯病菌的菌株移至PDB培養(yǎng)基中，其他菌株移至番茄汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，過(guò)濾收集菌絲.所有供試菌株基因組DNA均采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)提取.

1.3 引物的設(shè)計(jì)與篩選

根據(jù)立枯絲核菌的保守區(qū)(GenBank登錄號(hào)為JQ313811.1)，應(yīng)用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物RsF/RsR，根黑腐病菌采用特異性引物TBF/TBR[7]、煙草黑脛病菌和猝倒病菌采用張麗芳等[6]設(shè)計(jì)的特異性引物.引物由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成，引物序列見(jiàn)表1.

表1 用于多重PCR擴(kuò)增的特異性引物

1.4 多重PCR檢測(cè)方法的建立及條件優(yōu)化

1.4.1 單項(xiàng)PCR檢測(cè) 分別以4種供試病原菌的DNA為模板，用相應(yīng)的引物進(jìn)行單項(xiàng)PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系(25 μL)：TaKaRa LaTaq酶(5 U·μL-1) 0.2 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ (Mg2+Free) 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1) 2.5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1) 4.0 μL，上、下游引物(20 μmol·L-1)各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，添加ddH2O至25 μL.反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min.取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析比較.

1.4.2 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)多次重復(fù)試驗(yàn)和經(jīng)驗(yàn)，以及查閱文獻(xiàn)[8]發(fā)現(xiàn)，影響多重PCR反應(yīng)結(jié)果的因素主要為退火溫度，以及dNTP Mixure、Mg2+和TaqDNA聚合酶濃度等.因此，本試驗(yàn)將主要對(duì)這些反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而確定多重PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系和程序.

(1)Mg2+(25 mmol·L-1)添加量:在其他條件不變的情況下，將25 μL體系中Mg2+的添加量分別設(shè)2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 μL等6個(gè)處理.

(2)dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)添加量:在其他條件不變的情況下，將25 μL體系中dNTPs的添加量分別設(shè)2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μL等6個(gè)處理.

(3)LaTaq酶(5 U·μL-1)添加量:在其他條件不變的情況下，將25 μL體系中LaTaq酶的添加量分別設(shè)0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 μL等6個(gè)處理.

(4)退火溫度:在多重PCR反應(yīng)體系中，將退火溫度按照1 ℃梯度設(shè)定為53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 ℃.

1.4.3 多重PCR反應(yīng)特異性檢測(cè) 以煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌的基因組DNA隨機(jī)等量組合作為模板，用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證多重PCR反應(yīng)的特異性.

1.4.4 多重PCR反應(yīng)靈敏度檢測(cè) 經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定煙草黑脛病菌、猝倒病菌、根黑腐病菌和立枯病菌的DNA模板濃度，從初始濃度開(kāi)始依次按100-105梯度進(jìn)行倍比稀釋.按照已經(jīng)優(yōu)化的多重PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)定多重PCR的靈敏度.

1.5 多重PCR檢測(cè)方法的初步應(yīng)用

在烤煙生長(zhǎng)期的6-7月，從玉溪植煙區(qū)采集疑似病株樣本，用自來(lái)水洗凈染病根莖部，取病健交界處組織，切成4 mm2小塊，用70%酒精消毒30 s后，取其200-300 mg按Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)的方法提取樣品DNA.利用同樣的方法提取健康組織樣品中的DNA.以提取的健康組織樣品DNA為模板，煙草黑脛病、猝倒病、根黑腐病和立枯病病原物DNA為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水DNA為陰性對(duì)照，采用建立的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行電泳鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 單項(xiàng)PCR電泳檢測(cè)結(jié)果

以煙草黑脛病菌、猝倒病菌、根黑腐病菌和立枯病菌DNA作為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增分別得到265、364、400和541 bp的特異性條帶(圖1).

2.2 多重PCR檢測(cè)方法的建立及條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 最適Mg2+(25 mmol·L-1)添加量的選擇 在四重PCR體系中，當(dāng)Mg2+添加量為2.0-4.5 μL時(shí)均可擴(kuò)增出4條條帶，其中添加量為4.0 μL時(shí)，4條目的條帶均較為清晰(圖2).因此，本試驗(yàn)最終選擇4.0 μL作為最適Mg2+添加量.

M.250 bp DNA Marker；1.猝倒病菌；2.黑脛病菌；3.根黑腐病菌；4.立枯病菌.

2.2.2 最適dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)添加量的選擇 如圖3所示，當(dāng)dNTP Mixture添加量為4.0、4.5、5.0 μL時(shí)，均能擴(kuò)增出清晰的4條特異性條帶，而當(dāng)dNTP Mixture添加量小于4.0 μL時(shí)，只能擴(kuò)增出部分條帶.綜合各因素考慮，本試驗(yàn)將4.5 μL確定為最適dNTP Mixture添加量.

M.250 bp DNA Marker；1-6.dNTPs添加量分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μL；7.陰性對(duì)照.

2.2.3 最適LaTaq酶(5 U·μL-1)添加量的選擇 如圖4所示，當(dāng)LaTaq酶的添加量為0.20-0.45 μL時(shí)，均能擴(kuò)增出4條清晰的特異性條帶.其中，當(dāng)LaTaq酶添加量為0.20 μL時(shí)，就有非常清晰的4條目的條帶，并且拖尾現(xiàn)象較弱.因此，本試驗(yàn)將0.20 μL確定為最適LaTaq酶添加量.

M.250 bp DNA Marker；1-6.La Taq酶的添加量分別為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 μL；7.陰性對(duì)照.

2.2.4 最適退火溫度的選擇 從圖5可以看出，1-12泳道均出現(xiàn)了4條目的條帶，說(shuō)明在53-64 ℃下均能進(jìn)行PCR反應(yīng).但當(dāng)退火溫度為56 ℃時(shí)，4條目的條帶較為均一，所以本試驗(yàn)將其定為最適退火溫度.

M.250 bp DNA Marker;1-12分別為53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 ℃.

2.2.5 多重PCR反應(yīng)的特異性和靈敏度 如圖6所示，該多重PCR檢測(cè)體系具有較好的穩(wěn)定性，說(shuō)明其反應(yīng)特異性較強(qiáng).此外，本研究測(cè)得煙草黑脛病菌、猝倒病菌、根黑腐病菌和立枯病菌DNA模板的濃度分別為227、179、190和254 ng·μL-1.倍比稀釋擴(kuò)增結(jié)果如圖7所示，同時(shí)檢測(cè)4種病菌的靈敏度可達(dá)到10-2ng·μL-1基因組DNA.

M.250 bp DNA Marker；1.猝倒病菌和根黑腐病菌；2.猝倒病菌和立枯病菌；3、7.黑脛病菌和根黑腐病菌；4.黑脛病菌和立枯病菌；

M.DL2000 DNA Marker；1-6.模板依次稀釋100-105倍后的擴(kuò)增結(jié)果.

2.3 多重PCR檢測(cè)方法的初步應(yīng)用

取樣測(cè)定結(jié)果表明，4個(gè)陽(yáng)性對(duì)照均呈現(xiàn)相應(yīng)的特異性條帶;陰性對(duì)照、健康組織樣品均無(wú)擴(kuò)增;20個(gè)疑似病株樣品中有16個(gè)擴(kuò)增出364 bp的特異條帶,2個(gè)擴(kuò)增出400 bp的特異條帶,1個(gè)擴(kuò)增出265 bp的特異條帶,1個(gè)擴(kuò)增出364和400 bp的特異條帶.這些結(jié)果表明，所采集的疑似病株樣本中以煙草黑脛病為主，根黑腐病、猝倒病偶見(jiàn)，極個(gè)別存在煙草黑脛病、根黑腐病復(fù)合侵染現(xiàn)象，未見(jiàn)立枯病.

3 討論

多重PCR具有檢測(cè)時(shí)間短、試驗(yàn)成本低以及快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于病菌的檢測(cè).但是，多重PCR要求在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增，因而技術(shù)難度較大.在多重PCR反應(yīng)體系中，引物至關(guān)重要，合適的引物既能增加多重PCR的特異性，又能增加其敏感性[9].真菌的rDNA-ITS序列是中度重復(fù)序列，廣泛分布于基因組，國(guó)內(nèi)外已有利用真菌rDNA-ITS區(qū)域在科、屬、種水平上的差異，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行植物病害診斷和病菌檢測(cè)的報(bào)道[10-11].本研究中檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)也是基于此.

靈敏度是評(píng)價(jià)多重PCR反應(yīng)的重要指標(biāo)之一.本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，同時(shí)檢測(cè)煙草黑脛病菌、猝倒病菌、根黑腐病菌和立枯病菌的靈敏度可達(dá)10-2ng·μL-1基因組DNA.

[1] 陳瑞泰,朱賢朝.全國(guó)16個(gè)主產(chǎn)煙省(區(qū))煙草侵染性病害調(diào)研報(bào)告[J].中國(guó)煙草,1997(4):1-7.

[2] 王楠,王劍,尹丹韓,等.三重PCR檢測(cè)草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黃萎病菌[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(21):4392-4400.[3] 陳明潔,方倜,柯濤,等.多重PCR——一種高效快速的分子生物學(xué)技術(shù)[J].武漢理工大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(10):33-36.

[4] 謝燕婷,鄭敏,石磊,等.多重PCR快速診斷豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型與豬細(xì)小病毒方法的建立[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014,43(1):61-64.

[5] 鄭軒,成巨龍,趙震,等.五種煙草病毒TMV、CMV、TEV、PVY及TVBMV的多重RT-PCR同步檢測(cè)[J].植物病理學(xué)報(bào),2011,41(2):146-153.

[6] 張麗芳,陳海如,方敦煌,等.煙草青枯病、黑脛病和猝倒病的多重PCR檢測(cè)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2013,28(增刊):22-26.

[7] 趙永強(qiáng).煙草根黑腐病菌的分子檢測(cè)與室內(nèi)藥劑篩選[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[8] 黃銀花,胡曉湘,高宇,等.影響多重PCR擴(kuò)增效果的因素[J].遺傳,2003,25(1):65-68.

[9] 洪志,顏其貴,郭萬(wàn)柱,等.多重PCR技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷中的應(yīng)用[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2007,24(1):45-48.

[10] LI S, HARTMAN G L. Molecular detection ofFusariumsolanif. sp.glycinesin soybean roots and soil[J]. Plant Pathology, 2003,52(1):74-83.

[11] 曾曉葳,駱勇,周益林,等.基于小麥白粉病菌rDNA-ITS序列的PCR分子檢測(cè)[J].植物病理學(xué)報(bào),2008,38(2):211-214.

(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Simultaneous detection ofPhytophthoranicotianae,Thielavioisbasicola,PythiumaphanidermatumandRhizoctoniasolaniinfected tobacco by multiplex PCR

LIU Ping-hua1, FANG Dun-huang2, WU Zu-jian1

(1.Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;2.Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming, Yunnan 653100, China)

Four pairs of specific primers were designed according to rDNA-ITS of the four pathogensPhytophthoranicotianae(Pn),Thielavioisbasicola(Tb),Pythiumaphanidermatum(Pa) andRhizoctoniasolani(Rs). Specific fragments of 265 bp (Pa), 364 bp (Pn), 400 bp (Tb) and 541 bp (Rs) were successfully amplified by the multiplex PCR system based on the optimization of the concentration of Mg2+, dNTP Mixture,TaqDNA polymerase, and the annealing temperature. The detection sensitivity of four pathogens was nearly 10-2ng·μL-1DNA.

tobacco;Phytophthoranicotianae;Thielavioisbasicola;Pythiumaphanidermatum;Rhizoctoniasolani; multiplex PCR

2014-09-25

2014-12-22

中國(guó)煙草總公司云南省公司科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012YN05).

劉萍花(1990-)，女，碩士研究生.研究方向：煙草真菌病害.通訊作者方敦煌(1967-)，男，副研究員，博士.研究方向：煙草病害及其防治.Email：fdhkm@sina.com.

S435.72

A

1671-5470(2015)04-0345-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.04.002